Sei sulla pagina 1di 295

IN TER FASE

IL CICLO CELLULARE

G1 S
replicazione del DNA
crescita della cellula e duplicazione dei
cromosomi
e duplicazione degli organuli

G2
preparazione
della mitosi
i
cines
cito
fase
telo e
as se
af
e
etafa

an
as
af

profase
et

prom
m

mi
t
fas osi
eM
Il primo esperimento che consentì di evidenziare l’esistenza di
momenti nell’int erfa se essenziali per la successiva mitosi
impiegava fosfato marcato con 32 P che veniva somministrato a
meristemi radicali di una pianta, la Vicia Fab a . La rivelazione
con autoradiografia delle mito si ma rc ate a tempi crescenti
dalla somministrazione del tracciante fornì questo risultato:
Osser vaz ioni:
la prima mitosi marcata compariva dopo un tempo di
circa 6 ore dalla somministrazione del fosfato marcato
con 32 P
il numero di mitosi marcate aumentava successivamente
e raggiungeva il massimo dopo 16 ore , poi rimaneva
costante
Deduz ioni :
Il fosfato era inserito nel DNA di nuova sintesi in un
momento della vita della cellula a cui fu dato il nome di
fase S
Questa era separata dalla mitosi da un intervallo di tempo
(6-10 ore nell’esperimento) a cui fu dato il nome di fase G2
(GAP)
Tra la fase M e la S era interposto un intervallo che fu
denominato fas e G1
PARAME TR I D I CINE TIC A
CELLULARE
Consideriamo una popolazione teorica in cui tutte le
cellule sono uguali, si dividono e nessuna è persa per
morte o differenziazione
Tem po di ci cl o cell ul are somma della
durata Tc delle fasi del ciclo
cellulare

TEMP O T DcI èDU


perciò T G 1IONE
PLI =CAZ + T S +T T G 2 + T M
D
è il tempo che impiega una popolazione cellulare a
raddoppiare il num ero di cel lul e e in queste
condizioni teoriche è uguale a T C
MET OD I PE R V AL UT ARE L A D UR ATA
DEL C IC LO C EL LUL AR E
Si impiegano precursori marcati del DNA che sono
incorporati nel DNA di nuova sintesi durante la fase S
I metodi si differenziano in base al tempo di contatto
tra il nucleoside marcato e la popolazione cellulare e in
base al tipo di tracciante usato.

•marc atu ra a impuls o (pulse )


•marc atu ra continua
•doppia ma rcatura
•marc atu ra a im pulso (puls e )
La popolazione cellulare è messa a contatto con la 3 H-
Ti mi di na per un tempo lim it ato e fisso , in genere
non superiore a un’ora.
Una volta allontanato il tracciante, campioni della
popolazione cellulare eseguiti a tempi crescenti sono
valutati con l’autoradiografia.
Il parametro che si analizza è la per centual e di
cellule in mi tosi che risulta marcata rispetto alle
mi tosi total i

cioé il cosiddetto In dic e di Mit osi Ma rc ate


( IMM )
Si ipotizza che il T c e la dur ata delle fasi del ciclo siano
costanti e che le cellule siano as incr one e distribuite in
modo uni forme nel ciclo cellulare.

t=0 solo le cellule in fase S incorporano il nucleoside


marcato nel DNA di nuova sintesi. Dal nostro punto di
osservazione, la fase M , si vedono solo mitosi non
marcate.
t=1 il tracciante non è più a disposizione delle cellule;
in fase M si vedono ancora e solo mitosi non marcate
t=2 dopo un tempo uguale a G 2 in M compaiono mitosi
marcate, però in proporzione minima rispetto alle non marcate
t=3 la proporzione di mitosi marcate aumenta mano a
mano che arrivano in fase M le cellule che hanno
incorporato il nucleoside marcato in fase S
t=4 dal punto di osservazione in M si vedono solo
mit osi mar ca te e questa situazione permane finché
arrivano in M solo cellule che erano in S al momento
della marcatura
t=5 insieme alle mitosi marcate ne cominciano ad arrivare
alcune non marcate corrispondenti a cellule che al
momento della marcatura erano in G 1 e non potevano
assumere il tracciante
t=6 ; t=7 tutte le cellule che erano in fase S al momento
della marcatura si sono divise e dal punto di
osservazione in M si vedono solo mitosi non
marcate che corrispondono alle cellule che
erano in G 1 durante il pu ls e di timidin a .
Le cellule figlie marcate iniziano un nuovo ciclo.
t=8 le cellule figlie marcate iniziano ad arrivare di
nuovo in mitosi: si ha una seco nd a
gen er azio ne di mitosi marcate
Riportando in grafico sulle ordinate la percentuale di
mitosi marcate rispetto alle mitosi totali, IMM , in funzione
del tempo si ottiene una curva teorica:

t=4

t=3 t=5

t=0
t=1 t=2 t=8
t=6-t=7
Dal grafico risulta un trape zio i so scele .
la fase ascendente della curva è in relazione alla comparsa
della prima mitosi marcata
l’inizio del plateau 100% di mitosi marcate avviene quando la
prima mitosi marcata passa alla fase G1 del successivo ciclo
cellulare in quanto si è ipotizzato che le cellule fossero
distribuite in modo uniforme nel ciclo
l’inizio del tratto discendente avviene quando l’ultima cellula
marcata entra in mitosi
A B

La proiezione AB sull’asse delle ascisse del lato del trapezio


corrisponde al tempo della mitosi (T M ): infatti la prima mitosi
marcata entra nel punto dove inizia la parte ascendente della
curva ed esce quando comincia il plateau.
D E

A B F C

La proiezione BF sull’asse delle ascisse del plateau più la


proiezione della parte discendente FC della curva corrisponde
alla durata della fase S o T S perché comprende sia la scomparsa
della prima mitosi marcata (che al tempo del pulse era alla fine di
S) sia la scomparsa dell’ultima mitosi marcata che al tempo del
pulse era all’inizio di S.
D E

G H L M

A B F C

Poiché la base maggiore del trapezio AC corrisponde a T S +


T M e la base minore DE è T S – T M il valore di T S
geometricamente corrisponde alla distanza tra i punti medi dei
lati obliqui del trapezio cioè alla distanza tra i due punti di
T G2 è il tempo intercorso tra l’inizio del pulse e l’inizio del tratto
ascendente della curva.
Il valore di T C si ottiene per somma dei tempi delle fasi.
T G1 si ricava sottraendo da T C i valori di T S + T G2 + T M .
Nel caso limite di una popolazione si ncrona la curva
passa istantaneamente da 0 a 100% poiché tutte le
cellule della popolazione entrano in mitosi allo stesso
tempo.
La determinazione di T C
si ottiene senza
ricorrere al precursore
marcato: essendo le
cellule sincrone, sarà
A B
sufficiente osservare
l’ingresso delle cellule
in mitosi.
Il plateau AB è il T M
Cur va speri mentale
Le curve sperimentali differiscono da quella
teorica perché le condizioni postulate non si
verificano.

In realtà la durata delle fasi, la durata di TC e


la frazione di cellule presenti nell’unità di
tempo lungo il ciclo cellulare sono
variabili .
Quindi:
il tratto as cendent e non è una retta, ma una
sigmoide
invece del pl ateau si trova un massimo che non
raggiunge quasi mai il 100% di mitosi marcate
la parte di scendent e è anch’essa una sigmoide,
di pendenza minore
la curva non scende mai fino a 0
la curva del secondo ciclo presenta un massim o
di IMM inferiore rispetto a quello della prima curva
generalmente non si ottengono più di due cicli
cellulari
La presenza della prima sig moide è dovuta
alla grande variabilità di T G2 .
Inoltre la va ria bilit àdella durata delle altre
fasi del ciclo induce una certa
desincronizzazione nelle cellule marcate per cui
il massimo della curva non raggiunge il 100%.
La parte decrescente della curva non è
simmetrica con quella crescente a causa della
variabilità della fase S .
Il secondo picco di mitosi marcate è
inferiore al primo per la variabilità
comp le ssiva di T C .
La variabilità di T G1
è la causa del mancato
raggiungimento dello zero della parte
discendente della prima curva:
in pratica alcune delle mitosi marcate di
seconda genera zi one si trovano in
presenza di alcune delle mitosi marcate del
primo c ic lo .
Tipica curva della percentuale di mitosi ma rca te di
un tessuto:
si possono determinare solo il 50% e il picco di IMM
Epi tel io della guanci a di cri ceto
Anima le neo nat o Anima le giova ne

10 20 10 20

Anima le a du lt o Tum or e chem io-


ind ott o

10 20 10 20
•marc atu ra contin ua

Il nucleoside 3 H-Ti mi di na è lasciato per un


tempo indef ini to a disposizione della
popolazione cellulare. Si tratta di un metodo più
adatto per cellule in coltura che per tessuti
dell’animale da laboratorio in cui si devono
eseguire iniezioni ripetute per mantenere
sufficientemente elevato il livello ematico del
tracciante.
Dopo la rivelazione con autoradiografia si
determinano 3 p ara metri :

la frazione di mitosi marcate, IM M


la frazione di cellule marcate, cioè quelle in
fase S o In dic e di Ma rcatu ra
il conteggio del numero me dio dei
grani di Ag metallic o per ciascun nucleo
delle cellule della popolazione
la frazione di mitosi marcate, IM M

A B
temp o (o re)
La curva è simile a quella con marcatura a pulse, ma solo fino a
che si raggiunge il massimo di IMM , dopodiché si mantiene il
plateau a causa della marcatura continua.
Dalla curva si calcola un tempo che corrisponde a T G2 +
½T
la frazione di cellule marcate, cioè quelle in fase S o
Indi ce di Marcat ura

A B
temp o
Il valo re inizi ale dell’indice
(o re) corrisponde alla frazione di
cellule che erano in fase S all’inizio della marcatura continua.
Poi la curva aumenta linearmente poiché le cellule entrano in S
con velocità costante.
Il 100% è raggiunto quando tutte le cellule sono marcate
e cioè dopo un tempo pari a T G1 + T M + T G2
IN TER FASE
IL CICLO CELLULARE

G1 S
replicazione del DNA
crescita della cellula e duplicazione dei
cromosomi
e duplicazione degli organuli

G2
preparazione
della mitosi
i
cines
cito
fase
telo e
as se
af
e
etafa

an
as
af

profase
et

prom
m

mi
t
fas osi
eM
il conteggio del numero medio dei grani di Ag
metal lico per ciascun nucleo delle cellule della
popolazione

A B
Il numero dei grani di Ag per nucleo cellulare aumenta
progressivamente nel tempo fino a un massimo.
Quando il tempo di contatto tra precursore e cellula è uguale a T S
il numero medio di grani raggiunge il massimo.
Questo tempo corrisponde alle cellule che si trovavano all’inizio di
S ed hanno incorporato il nucleoside nel DNA durante tutta la
duplicazione: è T
Con questo metodo si determinano
separatamente considerando parametri diversi:

T G2 + ½ T M in dic e IMM

T G2 + T G1 + T M in dic e d i m arcatu ra

T S nume ro g rani Ag
•doppia marcatura
Il metodo consiste nel dare un primo “pulse”
di 3 H-T imidin a seguito da un secondo di
14
C-Timid in a dopo un tempo prefissato
Ta .
Il valore di questo intervallo è arbitrario,
purché minore di T S , in genere è un’ora.
Le cellule che sono in S al momento del
primo pulse sono marcate con 3 H-
Timidina .
Si distinguono in teoria 3 tip i di c ell ule
marc ate :
Quelle che al momento del secondo pulse
hanno già completato la S sono marcate solo
con 3 H.
Le cellule che al tempo del secondo pulse
sono ancora in S assumono anche 14 C-
Timidina e quindi sono doppia me nte
marc ate .
Le cellule marcate solo con 14
C sono quelle
che hanno iniziato la S dopo il pulse di 3H.
La marcatura dovuta ai due traccianti è
facilmente distinguibile con l’autoradiografia:
infatti i grani di Ag hanno dimensioni diverse a
seconda dell’energia emessa dal radionuclide.
Il 14 C emette radiazioni β di energia maggiore
rispetto al 3 H e quindi grani di Ag di maggiori
dimensioni.
Nei preparati in pratica si determinano:
le cellule marcate solo con 3 H
le cellule marcate con 14 C
Isotopo Per cor so T1/2 Tipo di Ene rgia
medio radiazioni (MeV)

3
H 1-2µm 12.5 a. beta 0.018
14
C 40-50µm 5600 a. beta 0.155
35
S 50-60µm 87 gg. beta 0.167
32
P 1-2mm 14.2 gg. beta 1.707
45
Ca 120-150µm 60 gg. beta 0.400
131
I 500-600µm 8 gg. beta, 0.607
gamma
t= 0 3 H-
Ti mi di na

3
H

G1 S G2 M

in terv allo Ta < T S


14
C-Ti mi di na

TS
Ta

14
C 3
H 14 C 3
H

G1 S G2 M
Se la popolazione cellulare è distribuita in modo
uniforme nelle fasi del ciclo e si conosce Ta :
C 3H : Ta = C 14C totali : TS
C 3H = Ta
C 14
C to ta li TS

da cui si calcola
TS = Ta C 14
C to ta li
Parametri di cinetica in tumori sperimentali
Anal isi del le mi tosi marcat e i n tum ori
umani
Anal isi del le mit os i mar cate i n tum ori umani

G2 S G1 Ti LI GF
G1 S G2 M T
In realtà quello che si verifica in una popolazione
cellulare real e è diverso in quanto:
la durata delle fasi del ciclo cellulare non è
costante per tutte le cellule

non tutte le cellule potenzialmente proliferative


percorrono il ciclo G0
Quindi
La proliferazione netta della popolazione
dipende anche da:
Il rapporto tra il numero di cel lul e che sono in
ci cl o, e quindi si realmente dividono, e il numero
totale di cellule comprese quelle potenzialmente
proliferative , ma che al momento sono nella fase di
qui escenza prol iferati va (G 0 )
si definisce il parametro

FRAZION E D I CRESCITA o
Gr owt h F raction (G F)
Parametri di cinetica in tumori sperimentali
Con l’introduzione della Frazione di
Crescita il tempo che la popolazione
impiega a raddoppiare è più lungo di T C e
prende il nome di temp o di
raddoppiame nto potenziale , T P
Nelle popolazioni cellulari reali vi sono, poi,
fenomeni di mo rt e , mig ra zi one , e
diffe renzia zio ne che ne condizionano la
crescita e nel loro complesso sono indicati
come
Fatt ore di Pe rdita Cellu lare o
Cell L oss (C L)
Ria ssu mendo
La cin etica di una popolazione cellulare è
determinata da parametri riguardanti la
produzio ne di cellule
T C
GF
e da fattori relativi alla perd ita di cellule
CL
Il numero di cellule della popolazione reale
raddoppia in un tempo, chiamato tempo d i
raddopiamento re ale , T D
Se tutte le cellule sono in ciclo
GF = 100% e
TC = TP
Se nessuna cellula è persa
CL = 0 e
TP = TD
Compart imento
prol iferat ivo
G2
Dif ferenziaz io
S ne

M
G1

G0 Mort e

Fa se d i
qu ies cen z
a
pr olife rati
Mo delli d i crescita di p opolazioni
cellu la ri
L’analisi della crescita di popolazioni batteriche è servita
per elaborare relazioni matematiche che esprimono
l’andamento del numero di cellule in funzione del tempo.
Curva di cresci ta di batteri con tempo di
generaz ione di 30 mi nuti
La curva della crescita batterica presenta analogie con
le curve di crescita di cellule di mammifero
Come già osservato la crescita è influenzata da
numerosi fattori:
Rel ati vi al tipo di cel lul e
dimensioni dell’inoculo per i batteri e num ero di
cel lule e loro fase di crescita per le cellule di
mammifero in coltura

Rel ati vi al l’ ambi ente di col tura


temperatura, terreno, siero, fattori di crescita, fase
gassosa, pH
MO DEL LO TE OR IC O D I C RES CIT A
L’aumento del numero di cellule di una popolazione è
funzione esponenziale del tempo:
N( t) = N 0 e kt
dove:
N(t) è il numero di cellule al tempo t
N0 è il numero di cellule al tempo 0
k è la costante di crescita in rapporto al tempo di
duplicazione
t tempo
La premessa iniziale è:

Tutte le cellule sono id entic he ,


percorrono il ciclo e quindi le singole fasi
con la ste ssa ve locità , non
mu oiono , non si diffe renziano e
non la scia no il compartimento
La crescita è
più rapida per
K1 > k2

Di conseguenza
T D1 < T D2
Legame tra k e T D :

per t = T D la popol az ione raddoppia il


numero ini zi al e di cel lul e
quindi:

N( T D ) = 2N 0
sostituendo questo valore nella

N(t) = N 0 e kt
si ottiene

2N 0 = N 0 e kTD
2N 0 = N 0 e kTD

semplificando si ottiene
2 = e kTD
passando ai logaritmi
ln 2 = kT D

k = ln 2
TD

TD = 0. 693
k
La crescita è
più rapida per
K1 > k2

Di conseguenza
T D1 < T D2
La funzione generale si può esprimere:

N(t) = N 0 e (0.6 93/TD)t

Riportando su scala decimale i valori dei logaritmi di N


in funzione del tempo si ottiene la retta che esprime
l’andamento esponenziale della crescita.

Dalla curva di crescita si può misurare il T D che


dipende dalla pendenza della retta, cioè dal
valore di k , da T C e dalla quantità di cellule che
si dividono in un tempo t .
Le condizioni perché T C sia uguale a T D sono:

tutte le cellule devono avere lo stesso T C

tutte le cellule devono essere in ciclo

le cellule non devono mo rire o


scomparire dal compartimento
tutt e l e cellu le devo no a vere lo s te sso T C

Per quanto riguarda T C in una popolazione


omogenea per tipo cellulare, il tempo che
le cellule impiegano a percorrere il ciclo è
varia bile in modo casuale, per cui
generalmente si parla di tempo medio
di ciclo c ell ula re .
Nel caso teorico in cui le cellule hanno lo
stesso TC e tutte le cellule sono in ciclo

GF = 100%
e
TC = TD
tu tt e l e c ell ule devo no e sse re in cic l

Questa condizione si verifica solo raramente e


in condizioni “li mite ”.
Infatti nelle popolazioni cellulari reali esistono
due frazioni di cellule: quelle che sono
proliferanti e quelle che normalmente non
proliferano.
Quindi la fr azio ne di c re sc ita non è
100%.
Parametri di cinetica in tumori sperimentali
le cellu le non d evono m orire o
scomparire d al c ompart ime nto

Entra in gioco, quindi, l’altro fattore che


condiziona la crescita di una popolazione
cellulare:
il fa tt ore d i p erd ita cellu la re o
C ell Loss (C L)
Il caso più semplice per inserire CL
nell’equazione di crescita è considerare la
perdita cellulare proporzionale al numero di
cellule presenti, cioè
dN = (k 1 – k 2 ) N
dt
dove k 1 è la costante di crescita della
popolazione dipendente dalla pro life ra zi one
delle cellule e k 2 è la costante che esprime la
perdita cellu la re .
Integrando l’equazione si ha:
N( t) = N 0 e (k 1-k2 )t

per
k 1 maggiore d i k 2
la popolazione è in c rescita

Esempi: tessuti in accre scimento quali


quelli embrionali, tumori etc. in cui la
proliferazione comporta un aumento del
numero di cellule
quando, invece, k 1 è min ore d i k 2
la popolazione è in dimin uzio ne

Esempi sono tessuti in cui la produzione di


nuove cellule non comp ensa quelle che
muoiono come in situazioni di malattia,
invecchiamento o dopo trattamenti citotossici

quando k1 = k2
la popolazione è stazio naria

Esempi sono i tessuti in equil ib rio


din amico in cui le cellule prodotte sono in
numero uguale a quelle che muoiono, tutti gli
Tornando alla relazione tra T D e
la costante di crescita

TD = 0.6 93
k

essa si modifica in:

TD = 0.6 93
(k 1 – k 2 )
E’ necessario tenere in considerazione, poi,
che le cellule in ciclo (quelle che proliferano)
hanno una probabili tà di dividersi non
sempre uguale a 1 .
Una parte delle cellule, infatti, perde la
capacità proliferativa per differenziazione

P
D P
Es. P P P
P P
P
D
Il modello teorico proposto (Elk in d 1967 )
considera una probabilità di dividersi
compresa tra 0 e 1 .
Supponiamo che questa probabilità sia
costante nel tempo e uguale per ogni cellula
proliferante.
A seconda che il valore di probabilità sia,
per la popolazione cellulare considerata,
maggio re , uguale o min ore di 0.5
l’andamento della crescita cambia.
p= 1
100P 200P
400P

p= 0.5

50P
50P 100
50P 100
50D
100 50D
50D
p= 0.6
86P
72P 144
60P 120 58D
100 48D
40D

p= 0.4
26P
32P 64
40P 80 38D
100 48D
60D
Cellule proliferanti

Se p è maggior e di 0. 5 la popolazione cellulare


prol iferante è in espansione
Se p è uguale a 0. 5 la popolazione cellulare
prol iferante è in equi li bri o
Se p è mi nore di 0. 5 la popolazione cellulare
prol iferante è in di mi nuzi one
Passando a considerare la crescita della popolazione in
toto , cioè nel suo insieme di cellule proliferanti e non, i
rapporti reciproci tra le due frazioni cellulari cambiano a
seconda del valore di p.

Se p= 0. 5
N° cellule totali
le cellule proliferanti
N° cellule proliferanti rimangono costanti
nel tempo, mentre
aumentano le non
proliferanti.
La popolazione in
toto
p=0.5 cresce
p= 0. 5
50P
50P 100
50P 100
50D
100 50D
50D
N° cellule totali

N° cellule proliferanti

p<0.5

Se p< 0. 5
Il numero di cellule prol iferanti di mi nui sce nel
tempo, mentre il numero total e della popolazione
cresce lentament e fino a raggiungere un valore che
rimarrà costante nel tempo.
p= 0. 4
26P
32P 64
40P 80 38D
100 48D
60D
Se p è maggior e di 0. 5 si ha un aumento sia delle
cellule proliferanti sia delle cellule non proliferanti, per
cui la popolazione cresce continuamente

A GF = 75%

B GF = 37%
C GF = 12%

p= 0.8
p=0. 6
86P
72P 144
60P 120 58D
100 48D
40D
Le popolazioni cellulari in crescita possono essere divise
in:
in espansi one in cui si verifica un aumento del
numero di cellule
in equi libri o in cui il numero di cellule rimane
costante
in di mi nuz ione in cui il numero di cellule
diminuisce
Le variazioni del numero di cellule della popolazione
dipendono da:
variazione del numero di cellule dovuto alla
prol iferaz ione all’interno di un determinato
compartimento
quantità di cellule che ent rano nel compartimento
quantità di cellule che escono dal compartimento
Gli spostamenti in entrata e uscita si possono verificare
per di fferenz iaz ione o mort e in uno stesso
compartimento o per mi graz ione tra due
compartimenti diversi
Cellule in
continua
prolif erazione
es. epide rmide
Sintesi di DNA

mitosi
Cellule non
prolif eranti
Cellule
es. miocita
quies centi
cardiaco e
es .
neurone
epatocita
Contr oll o del c iclo cellu la re
La rip ro duzio ne è probabilmente la
caratteristica fondamentale delle cellule.
I cicli di crescita e di divisione delle cellule
hanno come conseguenza:
una cellula batt erica può formare una
colonia di milioni di cellule in una sola notte di
incubazione
l’uovo fe condato dà origine alle oltre 1013
cellule che costituiscono il corpo umano
La corr etta progressione nel ciclo
cellulare è la condizione indispensabile
perché la divisione abbia come risultato la
produzione di cellule figlie con genoma
in ta tt o.

I me ccanis mi che regolano la progressione


in ciclo sono per molti aspetti conserva ti
dai lieviti ai mammiferi.
T C delle cellule
proliferative
umane è circa =
24 ore

T G1 = 11 ore

T S = 8 ore

T G2 = 4 ore

T M = 1 ora

La durata del ciclo cellulare varia anche in funzione del


com mi ssi onament o (es. cellule intestinali
staminali rispetto alle principali)
Nel liev ito

T C = 90 mi nuti

Nelle prime fasi dello sviluppo dell’em bri one :


T C = 30 mi nuti circa
si alternano solo fase S e fase M: lo scopo è la
mol ti pl icazi one delle cellule, non la loro
cresci ta
Il control lo della progressi one nel ciclo
cellulare è svolto da:
Segnal i extr acell ul ari
disponibilità di sostanz e nutr it ive ,
azione di fattori di cr es ci ta

Segnal i intracel lul ari


moni tor aggio della crescita cellulare
coordi nament o dei processi delle fasi del
ciclo in modo che avvengano con la
sequenza corretta e nessuna fase abbia inizio
prima che sia completata la precedente
REG OLAZ ION E DEL CI CLO CE LLU LAR E
CH ECK PO INT G 1 transizione da G1 a S
È stato definito in Saccharom yces cerevi siae
STA RT
Il passaggio del checkpoint START è
controllato dalla disponibilità di sostanze
nutritive, fattori di accoppiamento e dalle
dimensioni cellulari.
Passato ST ART , la cellula è commissionata a
entrare in fase S e a dividersi.
Il ciclo si arresta se le sostanze nutritive non
sono sufficienti oppure se opportuni
polipeptidi (fa ttori di accoppia mento )
segnalano alle cellule aploidi di fondersi l’una
con l’altra invece di procedere in S.
STA RT
regola inoltre
la
progressione
in ciclo in
funzione
delle
dimensioni
della cellula
figli a .

Infatti essa è prodotta per gemmazione ed è perciò molto


più piccola della cellula madre : START è accoppiato ad
un meccanismo che coordina le dimensioni cellulari
minime richieste con la progressione in ciclo.
La cellula figlia trascorrerà un tempo più lungo in G1 e
Nella maggior parte delle cellule animali il checkpoint in G1
detto “ punto di restri zione ” controlla la transizione
G1-S.
La regolazione è svolta principalmente da fatt ori di
cresci ta extracellulari che promuovono la proliferazione.
Se i fattori di crescita
sono presenti le cellule
entrano in S, altrimenti si
ha l’arresto in G1 e
l’ingresso in G0.
Es. i fibroblasti cutanei
sono reclutati in ciclo da
PDGF rilasciato dalle
piastrine quando deve
essere riparato il danno
dovuto ad una ferita
CHE CK PO INT G 2
In Schiz osaccharomyces pombe il controllo del
ciclo cellulare avviene essenzialmente nella transizione
da G2 a M
S. pombe si riproduce
per fissione : la
citocinesi avviene in
G1 .
Il controllo della
progressione in ciclo
in funzione delle
dimensioni cellulari e
delle sostanze nutritive
avviene al checkpoint
G2 , cioè nella
transizione da G2 a M.
Nei verte bra ti gli oociti rimangono per
tempi molto lunghi in G2 fino a che la
stimolazione ormonale ne provoca l’ingresso
in fase M:
è u n e sempio di c heckpoin t in G 2

In G 2 si effettua il controllo della


duplic azio ne del genoma impedendo
l’ingresso in mitosi se il DNA non è
completamente replicato.
In G 2 si arrestano le cellule se si rileva un
danno al DNA, dando l’opportunità di
Anche in G 1 si effettua la verifica dei danni
al DNA.
L’eventuale arresto della cellula prima di
entrare in fase S dà modo di riparare il
danno prima che il DNA e quindi anche
l’alterazione siano replicati.
Nei mammiferi l’arresto in G 1 è mediato
dall’azione di p53 .
Un danno al DNA,
dovuto ad es. ad
irradiazione, induce
un rapido aumento
dei livelli di p53.

La proteina invia il
segnale di arresto
del ciclo al
checkpoint G1.
CH ECK PO INT M

È un punto di contr oll o situato alla fine della


mitosi che contribuisce a mantenere
l’in tegrità del genoma.
Il checkpoint attua il controllo dell’allineamento
dei cromosomi sul fu so mitotic o in modo
da garantire che un set completo di cromosomi
sia fornito alle cellule figlie.
Per es. l’incompleto allineamento dei
cromosomi provoca l’arresto della mitosi in
metafase.
I checkpoin t che assicurano la
trasmissione di un genoma completo alle
cellule figlie
Nel 1970 gli esperimenti di fusione cellulare di
Rao e Johnson chiarirono alcuni aspetti del
checkpoint G 2 .
Era noto che il meccanismo di controllo
preveniva l’inizio della mitosi prima che la fase S
fosse conclusa e impediva che iniziasse una
nuova fase S prima che la mitosi avesse dato
origine alle due cellule figlie.
In tal modo:
Solo un genoma comple to è distribuito
nella progenie
Il genoma è replicato solo una vo lt a per
ogni ciclo cellulare
Esperi ment i di fusione cel lul are

Fusione tra cellule in G1 e cellule in S:


il nucleo in G1 immediatamente iniziava a sintetizzare
il DNA il cit opl as ma del la
cel lul a in S conteneva evi dentemente
fattori prom uov ent i l a si ntesi del DN A
Fusi one tra cellule in S e cellule in G2:
Il nucleo in G2 non era in grado di iniziare la sintesi
del DNA la si ntesi del
DNA nel nucl eo in G 2 era impedi ta da un
meccanismo che preveni va la
repl icaz ione del genom a pr ima che la
mitosi fosse avvenuta.
Model lo di interpretazione del risultato:
Un “ licensi ng factor ” richiesto per la
replicazione del DNA si legava ai cromosomi durante la
mitosi
Il fattore era inatt ivato durante la replicazione del
DNA
Il fattore non poteva entrare nel nucleo finché
l’involucro nucleare è integro, cioè fino alla mitosi
successiva
Quindi la repl icazi one del DNA è bl occata fino
alla fase G1 del ciclo successivo
Le bas i mol ecol ari di questo meccanismo non
erano note
Sto coso durante la mitosi si appiccica al dna e permette la sua successiva replicazione.
Durante la replicazione (S) viene disattivato.
I fattori di ini zi az ione
erano presenti nel
citoplasma, come risultò da
altri esperimenti in cui si
dimostrò che cellule in
mitosi fuse con cellule in
altri stadi del ciclo cellulare
inducevano sempre la
condensazione della
cromatina nel nucleo delle
cellule non in mitosi.

La fusione di cellule
HeLa in fase M con
cellule di ratto in fase G1
induce nella cromatina di
queste ultime una
condensazione prematura.
Id entifi cazio ne d ell e molecole
responsa bili del c ontrollo d el ciclo
cell ula re

studi sugli oociti di rana 1971

studi sui lie viti 1970

studi su embrioni di riccio di mare


1983
studi sugli oociti di
rana

Gli oociti sono arrestati


in G2 fino a che la
stimolazione ormonale
con progesterone non
innesca l’ingresso nella
fase M della meiosi.
Microiniezione di citoplasma La microin ie zio ne di
citoplasma di oociti
stimolati con progesterone
induce l’ingresso in mitosi
negli oociti non esposti
all’ormone.

Un fattore citoplasmatico
degli oociti stimolati è
sufficiente a innescare la
transizione G2-M
Il fa tto re è stato chiamato
“ ma tu ration promoting fa cto r”
MP F
Successivamente MPF è stato trovato anche
nelle cellule somatiche dove provoca
l’ingresso in M

Regolatore g enerale d ell a


tra nsizio ne G 2- M
studi sui lie viti
Lo studio di S. cerevisiae ha portato alla
identificazione di mu ta nti sensibili alla
temp era tu ra detti

cdc
cel l divi si on cycl e m ut ants

La crescita di questi mutanti subisce l’arresto


in punti specifici del ciclo cellulare
Mutante cdc 28 temperatur a-
sensibile

Cellula
figlia
Temperatura Temperatura
permissiva non permissiva
Cellula
madre

Il mutante cdc28 si replica normalmente alla


temperatura permissiva, mentre alla temperatura
non permissiva STA RT ne blocca la
progressione in ciclo
Altri mutanti sono stati isolati da
Sc hizo saccharo my ces pombe , tra cui
cdc2 che arresta il ciclo sia in G1 sia alla
transizione G2-M.

cdc28 e cdc2 sono risultati geni omologhi


dal punto di vista funzionale e sono richiesti
per il superamento di ST ART e per l’ingresso
in M di entrambe le specie di lievito

La pro te in a codificata è stata chiamata Cdc2


Sv ilu ppi successiv i:
cdc2 codifica una pro tein c hin asi

prima indicazione del ruolo prominente della


fo sfo rila zio ne delle proteine nella regolazione
del ciclo cellulare
identificazione di un gene u mano
correlato a cdc2 e funzionante anche nel
lievito

conserv azio ne di questo gene regolatore


studi su embrioni di riccio di mare
Dopo la fecondazione gli embrioni vanno incontro
ad una serie di rapide divisioni.
Nel 1983 furono identificate due pro te ine
indispensabili per l’ingresso in M che si
accumulano durante l’interfase e sono
rapidamente degradate verso la fine della mitosi:
cic li ne A e B
La prova del ruolo delle ciclin e si ebbe nel
1986:
la microiniezione di cic li na A negli oociti di rana
innescava la tra nsizione G 2 - M

Nel 1988 MP F è stato purificato e la sua


caratterizzazione molecolare ha dimostrato
che è costituito da due su bunità
Cdc2
cic li na B
La cic li na B è una subunità con funzione
regola tric e richiesta per l’attività catalitica
della protein chinasi Cdc2 . Infatti l’attività di
MP F è controllata dall’accumu lo e dalla
degra dazio ne della ciclina durante la
progressione del ciclo.
Regol az ione di MPF

2 Fosforilazione
Defosforilazione
Thr 14

Tyr 15

Thr 161

MPF
attivo
Mitosi

1 Sintesi di
ciclina B

Defosforilazione Degradazione
della ciclina B
 La sintesi di cic lin a B inizia in fase S
 Si accumula e forma comple ssi con Cdc2
durante S e G2
 La formazione dei complessi porta alla
fo sfo ril azione di Cdc2 in 2 posizioni
critiche:
tr eonin a-1 61 richiesta per l’attività
chinasica di Cdc2
tr eonin a-1 4 e tiro sin a-1 5 con
funzione inib ito ria di Cdc2 e
formazione di complessi Cdc2-cic li na
B inattivi durante S e G2
Regol azi one di M PF

3
Defosforilazione
Fosforilazione
Thr 14

Tyr 15

Thr 161

MPF
attivo
4
Mitosi

Sintesi di
ciclina B

Defosforilazione Degradazione
della ciclina B
La defosfo ril azi one di treonina-14 e
tirosina-15 ad opera di una fo sfa tasi, Cdc25 ,
innesca la transizione G2-M
Cdc2 attivata fo sfo rila molte proteine
bersaglio e dà i nizio agli eventi della mitosi:
condensazio ne dei cromosomi
fr amm entazio ne della membrana
nucleare
organizza zione del fuso mitotico
Regol azi one di M PF

Defosforilazione
Fosforilazione
Thr 14

Tyr 15

Thr 161

MPF
attivo
Mitosi

Sintesi di
ciclina B

Defosforilazione 5 Degradazione
della ciclina B
Al termine della mitosi la cic lin a si
dissocia da Cdc2 e un’altra fosfatasi
rimuove il fosfato in Thr161

L’attività di Cdc2 innesca la


degra dazio ne della cic lin a B
attraverso un meccanismo prote olit ico
ubiquitina-dipendente

Con la degradazio ne della cic li na


B e l’in attiv azio ne di C dc2 , la cellula
esce dalla mitosi, completa la citocinesi e
torna in interfase
• Wee1 fosforila Cdc2 in Tyr 15
Myt1 fosforila Cdc2 in Thr 14
CA K fosforila Cdc2 in Thr
161
• Cdc25 rimuove i gruppi
fosfato inibitori da Cdc2

• Term inata la mitosi la


ciclina si dissocia da Cdc2
e viene degradata
SC HEMA DI INATTI VAZION E DI UNA
CICL INA
La pro gre ss io ne delle cellule attraverso
il ciclo cellulare dipende da enzimi la cui sola
attività è quella di fo sfo rila re altre proteine

L’attiv ità di questi enzimi è controllata da


subunità la cui concentrazione varia da
uno stadio del ciclo cellulare all’altro
Ne i l ie viti:
Transizione G 2 - M Cdc2 - cic li ne
mitotiche B
(Clb1, Clb2, Clb3, Clb4)

STA RT Cdc2 -cic li ne G 1


(Cln1, Cln2, Cln3)

Passaggio di S Cdc2 -cic li ne B


(Clb5, Clb6)
Model lo di
regol az ion
e del ci clo
cel lular e
nel li evi to
Negli eucarioti superio ri il ciclo cellulare
è controllato da:
Cic lin e
Cdk cyclin -dependent k in ases
protein chinasi correlate con Cdc2
Progressione G 1 -S Cdk2 , Cdk4 ,
Cdk6 cic lin e D
e E

Sintesi del DNA e progressione in S

Cdk2 -cic lin a A

Transizione G 2 -M Cdc2 (Cdk1 )-


cic li na B
I meccanismi molecolari fondamentali che
regolano l’attività delle Cdk durante il ciclo
cellulare sono:
Associazione con le cic li ne part ner
Attivazione dei complessi Cdk -cic li na
mediante fosforilazione di un residuo conservato
di Thr 161 ad opera di un enzima chiamato CAK
(Cd k- activ ating kin ase)
Fosforilazione inibitrice di Th r 1 4 e Tyr 1 5
Attivazione di Cdk per defosforilazione di questi
residui
Associazione con proteine inibitrici (CKI )
In ib itori di Cdk
I segnali extr acellu la ri arrivano alle
cellule attraverso Fatto ri di Crescita (GF )
che operano il controllo della progressione in
ciclo attraverso il restric tion point in G 1 .
La sintesi delle ci cl ine D è
indotta in risposta alla
stimolazione da parte dei GF .
Le ci cl ine D sono
sintetizzate finché sono
presenti i GF.
Se i GF sono rimossi prima
del passaggio del checkpoint
di G1 le ci cl ine D sono
rapidamente degradate e le
cellule entrano in G0.
Le due caratteristiche principali delle cic li ne
di tipo D sono:
In ducibil it à
Rapid o tu rn ove r
Le conseguenze sono:
Le cic li ne di tipo D sono “ inte gra trici”
tra i segnali provenienti dai GF e l’apparato
del cic lo c ellu la re

Consentono il contro llo della progressione


in G 1 a seconda della disponibilità di Fatto ri
di Cre scita
Tra le numerose anomalie trovate nei tumo ri
umani vi sono dife tti di regola zio ne del
cic lo cellu la re e difetti nelle vie di
segnalazi one intracellulare attivate dai
recettori dei GF .
Es. mutazioni che provocano l’espressione
continua di cic li na D1 sono presenti in
molti tumori umani come i linfomi e il cancro
della mammella.
Inoltre mutazioni che inattivano gli in ib ito ri
delle Cdk (es. p16 ) sono un reperto comune
a molti tipi di cancro.
La connessione tra cic li na D , controllo della
crescita e cancro è dimostrata dalla mutazione
frequente in molti tumori umani di un
substr ato proteic o dei complessi Cdk4 -
cic li na D .

La proteina, Rb , è stata identificata come


prodotto di un gene responsabile del
retin obla stoma
raro tumore ereditario dell’occhio che si
manifesta nell’infanzia.
Le mu tazio ni che portano all’assenza della
proteina Rb funzionante non sono esclusive
del retinoblastoma, ma compaiono anche in
altri tumori umani.

Rb è il prototipo dei geni oncosoppressori ,


la cui in attiv azio ne è coinvolta nello
sviluppo dei tumori e i cui prodotti agiscono
come freno mole cola re della progressione
in ciclo.
Rb accoppia la regolazione del ciclo cellulare
all’espressione di geni richiesti per la sintesi del
DNA

Rb non fosforilata (G0 e inizio G1) si lega


ai fattori di trascrizione E2 F che regolano
l’espressione di geni coinvolti nella
progressione in ciclo e nella sintesi di DNA

I fattori E2F si legano alle sequenze


bersaglio, ma Rb sopprime la trascrizione
dei geni regolati da E2 F
La fo sfo rila zio ne di Rb ad opera dei
complessi Cdk4-c ic lin a D provoca la sua
dissociazione da E2F che attiva la
trascrizione dei geni per la sintesi del DNA
Il controllo di Rb per mezzo della sua
fosforilazione ad opera dei complessi Cdk4-
cic li na D collega questa critica
regolazione dell’espressione genica con la
disponibilità dei GF nella fase G 1 .
La proliferazione è regolata non solo da
segnali positivi , es i GF , ma anche da
segnali che in ibiscono la progressione in
ciclo.

Es. agenti che provocano un danno al DNA


inducono l’arresto del ciclo cellulare per dare
tempo alla cellula di riparare il danno.
Ma anche molti fattori extracellulari inibiscono
la proliferazione delle cellule bersaglio.
Questi se gnali sono mediati da molecole
regolatrici del ciclo e frequentemente sono
integrati dall’induzione di inibito ri delle
Un inibitore extracellulare della proliferazione
delle cellule animali, TG F-β , agisce
negativ amente sulla proliferazione di
numerosi tipi di cellule epiteliali mediante
arresto in G 1 della progressione in ciclo.

L’azione di TGF -β è mediata dall’induzione


di p15 e p27 che si legano ai complessi
Cdk4-cic lin a D .
Il blocco di Cdk4 inibisce la fosforilazione di
Rb e si ha l’arresto del ciclo in G 1 .
The Cdk inhibitor p27 in human cancer:
prognostic potential and relevance to anticancer
therapy

Nature Reviews Cancer 8, 253-267, 2008


Arresto del ciclo in risposta a
danno al DNA mediato da p53

p53 è un regolatore della


trascrizione che agisce, tra
l’altro, stimolando l’espressione
di p21 , inibitore delle Cdk .
p21:
Inibisce vari complessi Cdk-
ci cli ne e quindi impedisce la
progressione del ciclo cellulare
Inibisce direttamente la
sintesi del DNA legandosi a
PC NA , subunità della DNA-
polimerasi δ
Un altro esempio che dimostra la complessità
del controllo del ciclo cellulare, in particolare
nei confronti del danno al DNA deriva dallo
studio di una sindrome:
l’Atassia –telangettasia (AT )
Si tratta di una malattia ereditaria caratterizzata
da sintomi multipli: postura incerta (atassia )
dovuta alla degenerazione delle cellule nervose
cerebellari, vasi sanguigni del volto e di altre
parti del corpo dilatati (tela ngett asia ),
disfunzioni del sistema immunitario, elevato
numero di aberrazioni cromosomiche e
aumento del risc hio di sv ilu ppare
alc uni tip i d i c ancro.
La scoperta di questa malattia (fine anni ’60)
avvenne rilevando che alcuni pazienti
sottoposti a radioterapia sono estremamente
sensib ili alle radia zio ni io nizza nti .
Le cellule di questi pazienti sono incapaci di
riparare il danno al DNA perché i meccanismi
di controllo del ciclo cellulare non sono attivi.
Il gene ATM , responsabile della malattia,
codifica una pro tein chin asi che fa parte
di un complesso formato da molte subunità in
grado di riconoscere le lesioni del DNA,
comprese le rotture su entrambi i filamenti.
ATM si lega al danno sul DNA ed emette
segnali che inducono l’arresto del ciclo
cellulare.

Mutazioni di ATM alterano il punto di


controllo, di conseguenza non si genera il
segnale di ST OP e i soggetti affetti da AT
hanno, perciò, un rischio molto elevato di
sviluppare tumori.
ATR è stata identificata come parente stretto
di ATM .
G2
DNA
repli cato
corr etta ment
e
G2
DNA non
repli cato o
danneggia to
ATM e ATR attivano
Chk1 e Chk2 che
inattivano Cdc25. Cdc25
lascia Cdk nello stato
fosforilato inattivo.
• Wee1 fosforila Cdc2 in Tyr 15
Myt1 fosforila Cdc2 in Thr 14
CA K fosforila Cdc2 in Thr
161
• Cdc25 rimuove i gruppi
fosfato da Cdc2

• Term inata la mitosi la


ciclina si dissocia da Cdc2
e viene degradata
ATM attiva Chk2 che
fosforila p53.
p53 è così stabilizzata,
attiva p21 che a sua
volta inibisce i complessi
ciclina/Cdk.
Il riconoscimento dei danni sul DNA da parte di AT M e
AT R porta all’ar resto del ciclo sia in G 1 che in G 2 .
I punti di controll o richiedono
complesse interazioni di almeno tre
classi di proteine:
• Sensori che individuino le anomalie
ed emettano segnali
• Tra smettito ri che inviino i segnali
lungo le vie appropriate
• Effe tto ri che in risposta al segnale
inibiscano la progressione in ciclo
Squamoso Colonnare Pseudostratificato
TESS UT I
monostratificato semplice

EP IT EL IA
LI

Cuboide

Colonnare stratificato
Squamoso stratificato Cuboide stratificato

Multicellulare
Monocellulare Multicellulare
Prendendo in considerazione la cinetica
proliferativa

Si possono scomporre i tessuti in


comp art imenti , ovvero popolazioni di
cellule le cui caratteristiche sono:
l’in gresso di cellule nel compartimento da
altre popolazioni
la produzio ne di cellule all’interno del
compartimento
la perdita di cellule
Stati co chi uso : no proliferazione, perdita
scarsa, no ingresso, no uscita
In dim inuzi one : solo perdita di cellule
Stam inale : autorinnovamento,
proliferazione, uscita
Con divis ion e e t ra nsit o :proliferazione, ingresso e
uscita
Transi to sempl ice : solo ingresso e uscita
In divi si one chi uso : proliferazione, senza uscita e
senza perdita
I tessuti dell’ organismo adulto, salvo poche
eccezioni, sono in uno stato di equil ib rio .

I tessuti in rinnovamento si trovano in una


condizione di equili brio din amico e sono
costituiti dalle popolazioni cellulari descritte
unite l’una all’altra in numero e tipologia variabili.

In pratica i tessuti possono essere considerati


come asse mb la ggio di comp art imenti
con caratteristiche diverse.
Stami nal e : Transit o sem pli ce :
autorinnovamento, nessuna proliferazione, è
proliferazione e flusso rifornito dall’ingresso di cellule
verso altri compartimenti da altri compartimenti, ha
perdita cellulare
Con di visi one e transito :
si ha proliferazione, ingresso da
e uscita verso altri
compartimenti
I compartimenti dello schema hanno differenti
dimensioni: 1:7:16
Mucosa della laringe
Mucosa del colon
Pa rametri del la cine tica de lle
pop olazi oni cellul ari
Di me ns ion i numero di cellule
Temp o di tran si to tempo impiegato per
entrare e uscire dal
compartimento
Temp o di tu rnover tempo necessario per
sostituire tutte le cellule
del compartimento mediante
proliferazione e/o
ingresso e uscita
Se non c’è proliferazione e l’ingresso e l’uscita sono
uniformi il temp o di tu rno ver è uguale al
te mpo di tran si to .
CL ASSI FICAZIO NE DELL E POPO LAZION I
CEL LULAR I IN BASE AI COM PARTIM ENTI
Stati co e chius o neuroni
In dimi nuzi on e ovaio adulto,tumore
dopo terapia
citotossica
Transi to semp lice reticolociti,
porzione superiore
delle cripte intestinali
Con divi si one e tr ansi to midollo osseo,
cripte intestinali
In divi si one ch iuso coltura in
proliferazione,
tessuti in rigenerazione
(fegato), tumore
senza perdita cellulare
Stati co chi uso : no proliferazione, perdita
scarsa, no ingresso, no uscita
In dim inuzi one : solo perdita di cellule
Stam inale : autorinnovamento,
proliferazione, uscita
Con divis ion e e t ra nsit o :proliferazione, ingresso e
uscita
Transi to sempl ice : solo ingresso e uscita
In divi si one chi uso : proliferazione, senza uscita e
senza perdita
Si definisce cellu la staminale una cellula
che ha la capacità di dividersi
(auto rin novamento ) per un tempo
indefinito, spesso per tutta la vita
dell’organismo.
Nelle condizioni appropriate o se stimolata dai
segnali giusti la cellu la staminale dà
origine a molti tipi cellulari diversi
(differenziazione).
In altre parole la cellu la sta min ale ha la
potenzialità di dare origine a cell ule
ma tu re con diverse caratteristiche
morfologiche e funzionali (cellule cardiache,
cutanee o nervose).
Le definizioni di cell ula st amin ale
derivano dalle sue attribuzioni funzionali.
E questo pone inevitabilmente il problema della
manipolazione sperimentale che può anche
alterarne le funzioni in vivo.
Definizioni usate:
le cellu le sta minali sono cellu le
indiff ere nzia te capaci di:
a. Pr olif era re
b. Automante nersi
c. Pr odurr e un gran numero di
cellu le diffe renzia te
d. Rig enerare un te ss uto dopo un
danno
Molte delle definizioni dipendono dal
comportamento delle cell ule stamin ali
nell’organismo (in vivo ), in condizioni
artificiali (in vitr o ) o dopo tr apia nto in
vivo , spesso in un tessuto diverso da
quello da cui la cellula staminale proviene.
Es: l’uovo fecondato è detto totipote nte
per la sua potenzialità di generare tutte le
cellule e i tessuti dell’embrione e del feto.
L’uovo fecondato si divide e si differenzia
producendo un organismo completo

L’uovo fecondato è capace di dare origine agli


oltre 200 tip i diversi di cellule del
mammifero adulto: neuroni, miociti, epiteli,
cellule del sangue, osteociti, condrociti etc., ma
anche a cellule dei tessuti extraembrionali quali
la placenta e il cordone ombelicale.
In realtà la capacità di self renewi ng
dell’uovo fecondato e dei blastomeri è
limitata alle prime divisioni (stadio di
blastocisti-entro 5 giorni dalla fecondazione),
anche se hanno la potenzialità di dare un
organismo completo.
GIORNO 0: fecondazione in vitro

GIORNO 3: cellule totipotenti

GIORNO 5:BLASTOCISTI

Coltura di
ES totipotenti
Caratteristiche delle Cellule Staminali
Embrionali (ES)

ORIGINE:
da embrioni
pre-impianto o Blastocisti
peri-impianto

Cellule
SELF-RENEWAL: Staminali
le ES si dividono
per lungo tempo
senza differenziare
TOTIPOTENZA:
possono dare
origine alle cellule di
tutti e 3 gli strati
germinativi anche
ECTODERMA MESODERMA ENDODERMA dopo coltura in vitro

NEURONI CELLULE DEL SANGUE EPATOCITI


Il termine pl uri po ten te è spesso usato per
indicare le cel lule sta mi nal i che possono
dare origine alle cellule derivate da ciascuno dei 3
strati germinativi embrionali, meso derma ,
end od erma e ecto de rma .
Tutti i tipi di cellule specializzate che
costituiscono l’organismo derivano da questi 3
strati.
plu ri molti
toti tutto
Cell ula st amin ale unipote nte è il
termine usato per indicare una cellula
dell’organismo adulto capace di differenziare
in cellule di una sola linea.
Un i uno
La cell ula staminale adulta presente in
molti tessuti differenziati è unip ote nte e in
condizioni normali dà origine ad un tipo
cellulare o a cellule di una sola linea.
Se però il tessuto subisce un danno ed è
richiesta la sostituzione di vari tipi di cellule
possono essere reclutate o attivate cellu le
sta min ali plu rip otenti per riparare il
Il termine cellu la staminale adulta
è usato per indicare cellule staminali con
un fenotipo definito dal punto di vista
immunologico e con capacità di
differenziarsi nelle cellule mature dei
tessuti.
Si preferisce, però, chiamarle cellule
staminali tissutali perché si ritrovano
non solo nell’adulto ma anche nel feto, nel
neonato e nel bambino.
La struttura gerarchica è:

cellula to tip otente può dare


origine a tutti i tessuti

dell’organismo

cellula plu rip otente dà origine solo ad


alcuni tipi di cellule
o tessuti

cellula unip otente dà origine


solo ad una linea
cellulare
ESC
Cel lule stami nal i embri onal i
Lo studio delle cellu le st aminali
embrionali deve ancora superare molteplici
problemi:
Etici
Sperime nta li coltivazione nell’uomo
proliferazione-espansione
prevenzione del
differenziamento
tendenza verso la
differenziazione spontanea
instabilità cariotipica
mutazioni genetiche in coltura
marker di staminalità
La “cellu la st amin ale adulta ” o
“tissutale ” è una cellula indifferenziata (non
specializzata) che fa parte di un tessuto
differenziato.
Essa è capace di autorinnovamento e dà origine
alle cellule specializzate del tessuto da cui
deriva.
L’autorinnovamento dura quanto la durata della
vita dell’organismo.
La cell ula st amin ale produce un tipo o
tipi cellulari in terme di prima di
raggiungere la condizione di completa
differenziazione.
La/e cellula/e intermedia/e è chiamata cellula
precursore o pro genito re .
Si tratta di cellule che sono parzialmente
differenziate, ancora proliferanti e che danno
origine alle cellule differenziate.
Sono definite come cellule
comm issio nate a differenziarsi lungo una
via di sviluppo distinta, anche se le loro
caratteristiche possono non essere definitive.
Lin
foid
e

Progenitori

M
CLP

ie
lo
er
Cellule Staminali

it
GMP

ro
dei
HSC CMP MEP

Self-renewal Proliferazione
o e
Differenziamento Differenziamento
CELLULE STAMINALI
• con attività proliferativa illimitata;
• capaci di autorinnovamento;
• in grado di dare un gran numero di discendenti;
• attraverso un progressivo commissionamento acquisiscono
morfologia e funzioni diverse (differenziamento) riducendo
contemporaneamente la potenzialità proliferativa.
P2 pn

P1
P

S S1

cellule proliferative cellule differenziate


Mucosa della laringe
La cellu la sta min ale adulta o tissutale
presenta almeno due caratteristiche:
Produce copie identiche a se stessa per
lunghi periodi di tempo
(auto rin nova me nto o self- renewa l )

Origina cellule mature che presentano


tipica morfologia e funzioni specializzate.
Sorgenti di cell ule s ta min ali a dulte:
midollo osseo, sangue, cornea, retina, polpa
dentale, fegato, epidermide, tratto
gastrointestinale, pancreas, epitelio
bronchiale.

Le cellu le sta min ali adult e non sono


capaci di dare origine a tutte le cellule
dell’organismo.

A differenza di quelle dell’embrione non


sembrano essere plu ripote nti .
La funzione principale delle cell ule
sta min ali adulte è quella di mantenere
l’omeostasi e, con alcuni limiti, sostituire le
cellule che muoiono a causa di un danno o di
una malattia.
Le cell ule st amin ali a dult e sono rare.
Inoltre sono disseminate nei tessuti
dell’organismo ed hanno comportamenti
molto diversi a seconda del microambiente in
cui si trovano.
Es. solo 1 su 104-105 cellule nel midollo osseo
è una cellu la stamin ale emo poietic a .

Le cellule staminali emopoietiche


sostituiscono tutti i tipi di cellule mature del
sangue e sono costantemente prodotte nel
midollo osseo dove intraprendono la via del
differenziamento.
Le cellu le staminali dell’intestino tenue
sono separate fisicamente dalle cellule
mature a cui danno origine.

Le cellu le st amin ali intestinali si


trovano alla base delle cripte tra le cellule
mature dell’epitelio intestinale, si dividono
frequentemente e rimangono a far parte del
gruppo di cellule che esse generano.
Mucosa del colon
Origine della cell ula staminale adulta o
tissutale non è nota
Ipotesi: sviluppo durante la vita fetale come
popolazione di cellule di cui è stata fr enata la
differenziazione.
La maggior parte delle informazioni proviene
dagli studi sui roditori.
Per essere classificata come cell ula
sta min ale adulta una cellula deve
dimostrare di essere capace di self-renewal
durante la vita dell’organismo e dare origine a
una progenie di cellule con fe notip o
ma tu ro .
Questi requisiti sono difficili da provare in
vivo .
La cellu la staminale adulta dovrebbe
essere clo nogenic a , cioè capace di produrre
una linea di cellule identiche, e in grado di
differenziarsi nei tipi cellulari del tessuto in cui
risiede.
Anche questa proprietà è difficile da dimostrare
in vivo .
In pratica i ricercatori dimostrano che una
cellu la staminale adulta è
clo nogenic a in vitr o oppure che una
popolazione di candidate a essere cellu le
sta min ali a dult e può ripopolare il tessuto.
La cellu la staminale adulta deve dare
origine a cellule completamente differenziate
che possiedono il fe notip o ma turo , sono
integrate nel tessuto e sono capaci di eseguire
le funzioni specializzate proprie del tessuto.

Per fe notipo si intende il complesso delle


caratteristiche della cellula: morfologia,
interazioni con altre cellule e con la matrice
extracellulare, proteine di superficie e
comportamento della cellula (secrezione,
contrattilità, trasmissione sinaptica).
Tre metodi sono impiegati per dimostrare che
una candidata ad essere cellu la staminale
adulta dà effettivamente origine a cellule
specializzate:
Identificare un marker in viv o e seguirne il
destino
isola mento e identificazione di marker,
trapianto di nuovo nell’organismo per seguirne
il destino
isolamento, cre scit a in vitr o e
manip ola zio ne mediante GF o introduzione
di geni per riuscire a determinare quale tipo di
cellule differenziate è capace di produrre
E’ difficile, se non impossibile, distinguere la
cellu la st aminale adulta tessu to-
specific a dalla cellu la pro genitr ic e ,
già parzialmente differenziata, ancora
proliferante, che dà origine alle cellule
differenziate.
Le cellu le progenitrici producono alcuni
tipi di cellule, ma non sono capaci di
svilupparsi in tutti i tipi di cellule del tessuto.
Non sono vere s ta min ali .
Per le cellule sta min ali ema topoietic he
(HSC ):
Id entifi cazio ne e purific azio ne in
base all’espressione di marker di superficie
(CD34)
Dimo stra zione della fu nzio ne : una vera
HS C iniettata intravena in un ricevente
irradiato è capace di insediarsi nel midollo
dell’ospite e ripopolare tutto il sistema
ematopoietico.
Le cellu le sta min ali dei tessuti
dell’adulto possono generare cellule
specializzate di un tipo diverso rispetto a
quelle del tessuto in cui normalmente
risiedono.

Il termine pla stic it à significa che una cellula


staminale di un tessuto adulto è in grado di
produrre cellule differenziate di un altro
tessuto.
Termini equivalenti sono diffe re nzia zio ne
non orto dossa e
tra nsd iffe renziazione .
La pla sticità può essere:
produzione di cellule differenziate che
derivano dallo stesso strato germinativo
embrionale
produzione di cellule differenziate che
derivano da un diverso strato germinativo
embrionale

Es. si è dimostrato che cell ule sta min ali


del sangue (derivate dal me soderm a )
sono in grado di generare cellu le
mu scolari sc hele tric he , mu sc olari
cardia che e epatociti (me soderm a ),
ma anche neuroni (ecto derma ).
Stem cell
Pl asti ci tà delle
cel lul e
stam inal i
adul te
nell’animale da
laboratorio
Cellule staminali Cellule endoteliali
del muscolo dei vasi ematici

Muscolo
Midollo osseo
cellule staminali
emopoietiche cellule emopoieiche, osteoblasti
nella sede cellule endoteliali, fibroblasti, Fegato
precursori cellule mesenchimali

Sistema nervoso
centrale
considera zioni
(i dati per ora si riferiscono ad animali da
laboratorio)
le cellule sta min ali a dulte , presenti in
organismi adulti, sono difficili da isolare e da
coltivare intensivamente;
im piego clin ic o : la difficoltà di
espanderle e la comparsa di fenomeni di
senescenza ne limitano l’uso;
probabilmente le cellule st amin ali
adulte non sono assolutamente
specific he per il tessuto di appartenenza.
Appare necessario intervenire su di esse per
produrre cellule differenti.
Gli studi sull’isolamento e la moltiplicazione in
vitro di cellule stami nal i umane risalgono al
1998 con l’impiego di cellule embrionali e feti
abortiti.

Nel 1999 Vescov i e col l. hanno


trasformato cel lul e stami nal i nervose
prelevate dal cervello in cellule staminali
ematiche.
Mediante tecniche complesse le cellule nervose
(altamente differenziate) sono state
riprogrammate e indirizzate verso la
trasformazione in cellule del sangue.
Questo risultato ha contraddetto l’ipotesi precedente di
una stami nal ità t es suto- speci fica che appare,
però, ancora valida in condizioni normali, cioè senza
manipolazioni.
• La morfologia delle cell ul e stam inali non è
sostanzialmente diversa da quella delle cellule
proliferative e attualmente non sono stati identificati
marcatori molecolari specifici.

• In base ai risultati più recenti la “stam inali tà”


può essere distinta in due categorie:
• legata al mantenimento dell’omeostasi dei tessuti
(ricambio cellulare, rigenerazione dopo lesioni
locali);
• caratterizzata da totipot enza , chiaramente
dimostrata in vitro, per cui le cellule staminali
intervengono nella rigenerazione di qualsiasi tessuto
se sottoposte a stimoli opportuni.
Risposte
Quanti tipi di cellule staminali tissutali ci sono?
Quali sono le sorgenti di cellule staminali
tissutali nell’organismo?
Le cellule staminali tissutali sono dotate
normalmente di “plasticità”?
O lo sono solo quando manipolate?
A quali segnali sono sensibili?
PROS PET TIV E TERAPE UT IC HE
PO TE NZ IA LI

Numerose patologie potrebbero essere curate


usando cell ule st amin ali e mb rio nali
e/o te ssuto-specifiche .

3. Rig enerazio ne di c ell ule e te ssuti


E’ la principale applicazione delle cellule
staminali, che sostituiscono cellule o tessuti
danneggiati o non funzionanti, evitando il
trapianto di organi da cadavere.
1. Tera pia cellu la re per:
• Ri costi tuzi on e del midollo spinale
danneggiato da traumi fisici (già evidenziati nel
ratto precursori di oligodendrociti che
divengono cellule produttrici di mielina);
• Mal att ie de gen erati ve del Sistema
Nervoso Centrale (Alzheimer, Parkinson,
Huntington, Sclerosi laterale amiotrofica,
malattie ecotossicologiche post-traumatiche da
abuso di farmaci, da danno ischemico etc.);
• Mal att ie mus co lari e sch el etri ch e
(displasia ossea, malattie progressive delle
giunzioni ossee, osteogenesis imperfecta,
miopatie primitive);
• Ma latt ie infiammato rie di natura
sistemica (sindrome di Sjögren con salivari
atrofiche);
• Ma latt ie de ge ne ra tive di retina, cornea,
apparato uditivo i cui tessuti sono danneggiati
per cause genetiche o traumatiche;
• Ri costi tuzi on e del te ssu to ca rdi aco
dopo infarto acuto del miocardio e riparazione
dei va si danneggiati per ipertensione e
arteriosclerosi;
• Ma latt ie meta bol iche lisosomiali causate
da blocco di sistemi catabolici con accumulo di
sostanze non degradate.
1. Terapi a g eni ca
Le cellule stam ina li sono in grado di
accettare geni introdotti dall’esterno
con tecniche di trasferimento genico,
per correggerne alcuni difettosi o mutati.
Queste cellule sono capaci di trattenere i
geni inseriti, a differenza delle cellule
mature che progressivamente perdono
l’espressione di geni esogeni.
Il gene trasferito nelle cellule stam ina li
to tip ot en ti sarebbe presente, poi, in
tutte le cellule dell’organismo che
originano dalle staminali.
Identificare bersagli farmacologici
Valutare gli effetti terapeutici
potenziali
Prevenzione e
trattamento dei
difetti alla nascita
Studio del
Differenziamento
cellulare

Test di tossicità
?
Neuroni Cellule del
Epatociti
sangue

Ectoderma Mesoderma Endoderma


Tessuti/cellule per trapianto
Le cellu le staminali hanno la prerogativa
esclusiva di “ma ntenere” il proprio numero.
Se una cellu la st amin ale si divide e
entrambe le cellule figlie rimangono
sta min ali si ha una divisione simme tr ica .
Il risultato non è il “m antenime nto ” del
proprio numero, ma un costante incremento.

IN ESPANSIONE
Se c’è un me ccanis mo attraverso il
quale ad ogni divisione si rimuove una cellula
figlia, la popolazione è st abil e e il numero di
cellu le st aminali è costante .

STABILE
Un sistema per ottenere ciò è una divis ione
asimmetric a rigidamente controllata.

X= celula non-staminale

La di vi sione
asi mmet ri ca è il sistema
più sicuro per evitare di
perdere cel lule
stami nal i e per mantenere
costante il loro numero.
In situazioni in cui si richiede un incremento
delle cellu le sta min ali per compensarne la
morte, si può immaginare che le divis ioni
siano simme tr ic he , cioè che la cell ula
sta min ale dia due cellule figlie anch’esse
sta min ali .

Alterando la
proporzione dei due
e tipi di divisione, si
ottengono
modificazioni del
numero di cell ul e
stami nal i .
in media
Dal punto di vista concettuale una cellula
che produce due cell ule fig li e non
sta min ali non può essere considerata
essa stessa staminale perché non
soddisfa in criterio del “m antenere se
ste ssa” .

Tuttavia se consideriamo un pool di cellule


che contribuiscono tutt e al mantenimento
del numero delle staminali, il problema non
si pone.
È probabile che tutti e tre i tipi di divisione
possano verificarsi.

I fattori che
possono
determinare la
stami nal ità e
la non-
stami nal ità
(es.fattori di
in media
differenziazione)
manterrebbero la
condizione di
equilibrio.
Tr ansizio ne d a c ell ula sta min ale a
cellu la matu ra
La condizione più semplice è la connessione
diretta tra compartimento staminale e
compartimento delle cellule mature .
Tale situazione è
maturazione esemplificata dagli
stadi iniziali
dell’embriogenesi
e da alcune forme
di rigenerazione di
tessuti (es. ferite)
differenziazione
Un’ipotesi di questo tipo prevede una grande
popolazione di cellu le staminali che si
dividono per compensare la rimozione di cellule
per differenziazione e mantenere la condizione
di equilibrio.

maturazione

differenziazione
proliferazione

La popolazione di cellu le st amin ali


è esposta al rischio di errore genetico.
In tutti i tessuti si trovano cellule con funzioni
specializzate, spesso diverse, e le cellule
devono indirizzare energie e risorse nella
produzione di materiali e/o strutture, perdendo la
capacità di continuare a proliferare.
L’acquisizione delle prerogative della cell ula
ma tu ra richiede del tempo.
Il processo di maturazio ne può richiedere
uno o più eventi diffe re nziativi .
Una soluzione a questi problemi è l’introduzione
del compartimento con div isione e
tra nsito .
maturazione

differenziazione

Questa popolazione allevia molto del lavoro


delle cell ule sta min ali in termini di
produzione di cellule.
Di conseguenza il compartimento st amin ale
è più piccolo e meno esposto al rischio di
danno genetico e carcinogenetico.
Il modello richiede una serie di possibilità di
controllo per rispondere a condizioni di danno o
a richieste di variazione del flusso di cellule
verso il compartimento ma tu ro .
Epiteli o in testin ale

Teori a
uni tari a
dell’origine dei 4
ti pi pri ncipal i
di cell ul e
nell’intestino di
topo.
INTESTINO
TENUE INTESTINO
CRASSO
L’intestino tenue è caratterizzato da cellule che
hanno una rapid a progressione in ciclo,
da un ele vato ritmo di produzione cellulare
e da una pronunciata polarità sia a livello dei
singoli tipi cellulari sia a livello di intero
tessuto.
Inoltre, l’intestino tenue mostra una
evidente mig ra zi one delle cellule che
è visibile marcando le cellule nelle cripte
con 3H-Timidina e seguendo il loro
movimento verso il villo.
Nel topo la velocità di migrazione verso il
villo è 1-2 diame tri cellu la ri per
ora.
40’ 1g 2g 3g
Le cellule prodotte per mitosi nella cripta
vivono solo 2-3 giorn i , dopodiché hanno
raggiunto l’apice del villo e sono estruse nel
lume.

Il numero di divis ioni che una cellula ha


eseguito può essere valutato dalla riduzione
di intensità dei grani di Ag
nell’autoradiografia.
Le cellule marcate della regione superiore della cripta si
dividono una sola volta perché i grani di Ag sono
approssimativamente dimezzati. Queste cellule
raggiungono per prime l’apice del villo.

Le cellule
più in basso
nella cripta
si dividono
due volte,
quelle
ancora più
in basso 3.
L’epitelio della cripta è sostituito approssimativamente
ogni 2 giorni e le cell ul e stami nal i si dividono
circa una vol ta al gi or no .
Durante la vita dell’animale (3 anni circa) le cel lul e
stami nal i si dividono circa 1000 volte.

tenue crasso
Si ritiene che le cellule staminali siano localizzate
all’origine del movimento:
posizione 4.9±0.2 nell’intestino tenue e –0.2±0.2
nell’intestino crasso.
INTESTINO
TENUE INTESTINO
CRASSO
Una delle caratteristiche delle cell ule
sta min ali è rappresentata dalla potenzialità
di rigenerare la popolazione stessa delle
sta min ali e l’intero te ss uto dopo
esposizione ad un agente citotossico.

Il processo avviene mediante la crescita


clonale, ragione per cui le cell ule
sta min ali che esprimono questo potenziale
sono dette cellu le clo nogenic he .
Capacità delle cellu le sta min ali di
rigenerare il tessuto dopo un danno citotossico:
3-4 giorni dopo irradiazione si possono osservare
e contare crip te i n r igenera zi one

Controllo
Cr ipte in ri generaz ione 4 giorni dopo una
dose di radiazioni di 14.5 Gy
Si ottengono curve dose-ris posta per i foci
di cripte in rigenerazione che forniscono la stima
del numero di cellule che possiedono la
capacità clo nogenica di rigenerare la
struttura, cioè il nume ro di cell ule
sta min
Numero aliclonogeniche
di cellule . Il numero di cellule
cl onogeniche in una
cripta dipende dal livello di
danno indotto nella cripta:
maggiore è il danno,
maggiore è il numero di
cellule reclutate nel
compartimento clonogenico.
A basse dosi le cellule
clonogeniche sono circa 6 per
Dose (Gy)
cripta, a dosi più elevate ce
In ciascuna cripta
dell’intestino tenue del topo
ci sono circa 250 cellule
assemblate in una struttura a
forma di fiasco con circa 16
cellule in un anello preso a
metà altezza della cripta.
150- 160 cellule in rapida
proliferazione
30 cellule del Paneth
differenziate alla base della
cripta.
4- 6 cell ul e stami nal i
Intesti no
crasso
INT ES TINO T ENU E
topo
uomo
cell/colonna 25 34
cell/circonferenza 16 22
cell/cripta 250 450
TC 12 ≈33
TC cell staminali (ore) ≈24 ≥36
cell staminali/cripta 4-6 ?
cripte/villo 6-10 ≈6
cripte/intestino 1-3x106 ?
INT ES TIN O C RASSO
topo
uomo
cell/colonna 42 82
cell/circonferenza 18 46
cell/cripta 300-450 2250
TC ≈35 ≈34
TC cell staminali (ore) ≥36 ≥36
cell staminali/cripta 1-8? ?
In testino tenue In testino
crasso
Apoptosi ●Rara, associata alla posizione ●Ancora più rara
delle cellule staminali ●Non associata alla
(1-10% muoiono) posizione delle cellule
staminali
Proteina ●Non espressa ●Espressa nella posizione
Bcl-2 delle cellule staminali
Ruolo ●Rimuove cellule staminali ●Non è efficace nel controllo
apoptosi in eccesso del numero di cellule
spontanea●Contribuisce all’omeostasi staminali
delle cellule staminali e
dell’intera cripta
Apoptosi ●Molto efficace ●Bcl-2 previene la rimozione
Indotta ●Previene errori di riparazione del danno per apoptosi
●Efficace protezione del danno ●Cripte iperplastiche
(carcinogenesi) ●Cellule danneggiate e con
riparazione non completa
sopravvivono
●Aumento del rischio di
cancro
La particolarità dell’intestino come mo dell o
cellu lare bio logico è rappresentata dal
fatto che la posizione di una cellula all’interno
della gerarchia è correlata alla sua posizione
topografica nel tessuto.
Le caratteristiche, la risposta ad un danno e i
processi di regolazione possono essere studiati
e associati alla posizione in cui nella cripta si
trovano le cellu le staminali .
E’ necessario, però, sezionare le cripte
longitudinalmente e registrare le posizioni
cellulari a partire dalla base.
Con questo approccio nell’intestino tenue
molte caratteristiche sono state associate con
la posizione delle cell ule s ta min ali :
T C più lento (nel topo circa 24 ore)
Sono coinvolte nella rigenerazione dopo un
danno
Hanno un basso livello di apopto si
sponta nea nel topo e nell’uomo
Sono molto ra diosensibil i e muoiono
per apoptosi
Rappresentano l’inizio della mig ra zi one
Schema di una sezione longitudinale della
cripta intestinale.
E’ illustrato il sistema di numerazione e
conteggio delle posizioni cellulari.
L’analisi di queste cripte può produrre diversi tipi di
risultati sotto forma di grafici della frequenza del
parametro considerato.
Es: gli istogrammi rappresentano l’apoptosi 3 ore
dopo una dose di 0.63 Gy, la linea tratteggiata la
frequenz a di cel lul e prol iferati ve .
L’apoptosi (a) è
confrontata con la
distribuzione teorica
a
delle cellule staminali
(b) e con la
b distribuzione delle
cellule clonogeniche
(c) stimata sulla base
di calcoli matematici.

c Le tre curve hanno il


massimo intorno alla
posiz ione 4 .
Schema che illustra la gerarchia nel compartimento
staminale e il compartimento con divisione e transito
Ci sono 4- 6 cellule staminali vere S
Le staminali clonogeniche SC sono in numero maggiore
e variabile secondo le necessità
S P D M

T=1

T=
2

T=3
Alta dose effe tto le tale

S P D M

T=4

T=
5

apla sia
Dose s uble ta le
S P D M

T=4

T=
5

T=6

T=7
Condizio ne norm ale
Intestino tenue di ratto non irradiato

Azan Autoradiografia
Intestino tenue di ratto-dose 6Gy

Modificazioni assenti

30 minuti dopo l’irradiazione


1 ora

2 ore

Assenza o quasi di mitosi


Compaiono i frammenti nucleari o corpi
apoptotici
4 ore

6 ore

Aumento dei corpi apoptotici


Apoptosi

A sinistra: controllo non irradiato


Al centro: 6 ore dopo una dose di 1 Gy
A destra: 6 ore dopo una dose di 8 Gy
Le frecce rosse indicano le figure mitotiche, le verdi i
frammenti apoptotici
8 ore

12 ore

Nuclei rigonfi e male allineati, presenza di corpi apoptotici.


Le cellule alterate sono in posizioni superiori nella cripta.
Qualche rara figura mitotica.
20 ore

24 ore
28 ore

Le cellule alterate


continuano a migrare
verso il villo.
La modesta ripresa
della proliferazione
non compensa la
morte delle cellule e la
migrazione: le cripte
si riducono in altezza.
40 ore

48 ore

Il danno cellulare si è trasferito nel villo.


Cellule in mitosi nella cripta.
72 ore

5 giorni
Ripopolazione
48 ore dopo una dose di 12 Gy
72 ore dopo una dose di 12 Gy
4 giorni dopo una dose di 12 Gy
Rare cripte in rigenerazione 4 giorni dopo una
dose di 12 Gy
Distr ibuz ione dell e cel lule
marcate in funz ione del la
posi zi one nel la cr ipt a
Distr ibuz ione delle
cellule in mitosi

Distr ibuz ione delle


cellule mucipare
caliciformi
2 hrs

24 hrs
40 hrs 48 hrs

72 hrs
14 Gy 5 gg
14 Gy + TGFβ3 5 gg
SPF
SPF SPF