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TECNOLOGIE RICOMBINANTI

Permettono il trasferimento di DNA da un organismo ad un altro


= modificazione dell’espressione genica

DONATORE VETTORE RICEVENTE

Qualunque organismo Plasmide

Cosmide
Batterio (E.coli)
Virus

YAC

Bacmide…. Organismo eucariota


DAL GENE ALLA PROTEINA

Modificare il DNA di un organismo

significa essenzialmente produrre

alterazioni qualitative o quantitative

in una proteina
Come si realizza il trasferimento genico?
Si inizia con il “taglia e cuci”

ENZIMI DI RESTRIZIONE:
Permettono di tagliare il DNA in siti
precisi isolamento di un frammento
(es: un gene)

DNA-LIGASI: permettono di saldare insieme


Frammenti di DNA anche di origine diversa. Tale
Evento si chiama RICOMBINAZIONE ed il nuovo
DNA si definisce RICOMBINANTE
Taglia……..LE ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE

Tagliano a livello dei legami fosfodiesterei all’interno o a qualche base di distanza di un sito di

riconoscimento, generando un -OH in 3’ ed un -P in 5’ liberi


Source Microorganism Enzyme* Recognition Site (↓) Ends Produced

Arthrobacter luteus AluI AG↓CT Blunt


Bacillus amyloliquefaciens H BamHI G↓GATCC Sticky
Escherichia coli EcoRI G↓AATTC Sticky
Haemophilus gallinarum HgaI GACGC+5↓
Haemophilus influenzae HindIII A↓AGCTT Sticky
Haemophilus parahaemolyticus HphI GGTGA+8↓
Nocardia otitiscaviaruns NotI GC↓GGCCGC Sticky
Staphylococcus aureus 3A Sau3AI ↓GATC Sticky
Serratia marcesens SmaI CCC↓GGG Blunt
Thermus aquaticus TaqI T↓CGA Sticky
I batteri proteggono i siti di restrizione riconosciuti dai propri

Enzimi di restrizione con delle METILASI specifiche


…..E cuci: LA DNA LIGASI (fago T4)

Effettua un legame fosfodiestereo tra un 3’-OH ed un 5’-P liberi, anche di molecole di DNA

diverse, purchè temporaneamente vicini


VETTORE DI CLONAZIONE

Unità di DNA capace di replicazione autonoma (REPLICONE) dentro una cellula ospite, all’interno

della quale è possibile introdurre frammenti di DNA estraneo, che si moltiplicano unitamente ai

cicli replicativi del vettore stesso

plasmid

YAC
5-10 Kbp

300-1000 Kbp

Fago λ

15 Kbp

50 Kbp

Perché i vettori di clonazione replicano anche il DNA estraneo?


LA REPLICAZIONE DEL DNA IN E.coli

oriC: 9mer (dnaA) e 13mer ricchi in AT

DnaA: Si lega a 13mer e 9mer (COMPLESSO

DI INIZIO): inizia lo svolgimento del DNA

DnaC: carica DnaB per formare il

COMPLESSO DI PREAVVIO

DnaB (ELICASI): svolge il DNA

PRIMASI: sintetizza i primers

di RNA
DNA pol III: allunga l’elica

Nascente

DNA pol I: rimuove i primers di

RNA e li sostituisce con DNA


LA REPLICAZIONE DEL DNA NEL LIEVITO

ORC: Complesso di

Riconoscimento dell’Origine
ARS: Sequenze a

Replicazione Autonoma
ACS: Sequenza di

Consenso ARS

Primasi Dna pol α: inizia la sintesi

Dna pol δ: la prosegue


La replicazione del DNA è controllata dalla fase d’inizio: una volta

iniziata, la DNA polimerasi procede fino alla fine, replicando quindi

anche sequenze di DNA estraneo


Per clonare piccoli frammenti di DNA si usano i PLASMIDI

ORI

MCS

Marcatore per la selezione

6
Efficienza di trasformazione ≈ 10
Come si favorisce la formazione di vettori ricombinanti?

Utilizzo di due diversi enzimi Il metodo della fosfatasi alcalina

di restrizione
Utilizzo di due diversi enzimi Il metodo della fosfatasi alcalina

di restrizione

5’
3’
X
5’
3’

La FA rimuove il fosfato in -5’:

Il plasmide non può richiudersi su

se stesso
Dove si cerca un frammento di DNA di interesse?

LE LIBRARY (GENOTECHE) DI DNA

L. GENOMICHE L. di cDNA
Che cosa è una LIBRARY GENOMICA?

-E’ il DNA completo di un organismo (cellula) frammentato ed inserito in vettori

di clonazione. Contiene quindi anche il “junk” DNA (95% del DNA totale)

-Tra di essi è possibile individuare per “screening” (vaglio) uno specifico

frammento di DNA

TAGLIO DEL DNA


COSTRUZIONE

CLONAGGIO DEI FRAMMENTI IN UN VETTORE

INSERIMENTO DEI VETTORI RICOMBINANTI IN UN

OSPITE (E.coli, lievito…)


SCREENING

RICERCA DEL CLONE CONTENENTE

IL VETTORE CON IL FRAMMENTO DI DNA

CHE INTERESSA

Per La Costruzione Bisogna Procedere Diversamente Per PROCARIOTI Ed EUCARIOTI


Library genomiche da batteri

Il vettore di clonazione

è un plasmide
Un vettore di clonazione più efficiente:

IL FAGO λ

9
Efficienza ≈ 10
Geni per la lisogenia

(Integrasi/Escissionasi)

Geni per le proteine Geni per il ciclo

del capside e della coda litico

Questa regione viene

sostituita con DNA

Estraneo (≈15 kbp)

Estremità cos: sono estremità coesive di 12 bp

che servono per circolarizzare il DNA fagico

quando viene iniettato nel batterio


Si usano ceppi di E, coli che non permettono

la replicazione di fagi ricostituiti, cioè con

E/I intatti
COME SI ASSEMBLA IN VITRO UN FAGO λ

RICOMBINANTE?

PREPARAZIONE DI PARTICELLE COMPONENTI

IL FAGO λ

-Infezione di E.coli con un mutante del fago

difettivo della proteina A

-Produzione di concatameri, capsidi e teste:

il DNA non può entrare nel capside, quindi il

fago non viene assemblato

-Lisi di E. coli, con ottenimento di un estratto

ricco in teste e code

-Incubazione del lisato con proteina A esogena

e DNA fagico ricombinante contenente i siti cos

-Entrata del DNA nel capside ed assemblaggio

Del fago ricombinante


Quando si vogliono costruire library genomiche di DNA di cellule eucariote

bisogna tenere conto della dimensione del DNA

Dimensioni di library genomiche umane preparate in vettori di clonazione diversi

         Numero di cloni*
Tipo di vettore   Taglia dell’inserto (kb) P = 95% P = 99%

Fago λ             18 532 500                  820 000


Cosmide, fosmide       40 240 000 370 000
P1     125   77 000 118 000
BAC, PAC    300   32 000   50 000
YAC     600   16 000   24 500
Mega­YAC   1400     6 850   10 500
•Calculated from the equation: where N is the number of clones required, P is the probability that
 any   given   segment of the genome is   present in the library, a   is the average size  of the DNA
 fragments inserted into the vector, and b is the size of the genome.

OCCORRONO VETTORI PIU’ CAPIENTI E AD ALTA EFFICIENZA


Il DNA viene digerito parzialmente

Es: Sau3 (GATC): taglia sticky ogni circa 256bp

7
10 frammenti
9
Digestione completa del Genoma umano: (≈ 3x10 bp)
non sovrapposti
6
Digestione parziale: frammenti sovrapposti di ≈ 20 kbp (clonabilli nel fago λ) 10 cloni

LA DIGESTIONE PARZIALE: -Riduce il numero dei cloni

-Aumenta la probabilità che tutte le sequenze del

DNA genomico siano rappresentate nella genoteca


9
Efficienza di trasformazione ≈ 10
CLONAGGIO NEL COSMIDE
Inserti ≈ 45 Kbp

Una volta entrato in E. coli si replica come un plasmide

Vettore

navetta
YAC (Cromosoma Artificiale di Lievito)

CEN: serve per una corretta

segregazione

ARS: origine della Vettore

replicazione “navetta”

URA3: un enzima della via di

biosintesi dell’uracile

TEL: serve per stabilizzare

Lo YAC
CEN

Organism  Telomeric repeat sequence
Yeasts 
Saccharomyces cerevisiae                 G1–3T
Schizosaccharomyces pombe             G2–5TTAC
Protozoans
Tetrahymena             GGGGTT
Dictyostelium             G1–8A TEL
Plant
Arabidopsis            AGGGTTT
Mammal
Human            AGGGTT

T-loop
Si possono sfruttare le regioni sovrapponibili dei cloni (CONTIG), ottenute grazie alla

digestione parziale, per risalire alla loro posizione nel cromosoma


Le GENOTECHE cDNA

Poiché utilizzano come materiale genetico di

partenza l’RNAm:

-Contengono solo DNA genico

-Sono’ rappresentative dell’espressione genica


Fasi della preparazione della genoteca:
Di un dato tipo cellulare

a) Purificazione dell’RNAm

b) Sintesi del primo filamento di cDNA

usando come stampo l’RNAm

c) Sintesi del secondo filamento

d) Adattamento del cDNA per la


La purificazione dell’RNAm da un estratto di RNA totale

Si sfrutta la coda di poliA tipica dell’RNAm

La presenza del sale favorisce l’interazione

fra sequenze omologhe

NaCl 100mM

Tris 10 mM

EDTA 1 mM
La bassa forza ionica del tampone fa

staccare l’RNAm