Preparacin del frotis

Fijar con calor

Crubrir con cristal violeta y dejar reposar durante un minuto, despues lavar y escurrir.

Cubrir con lugol, dejar reposar un minuto y lavar con agua.

Decolorar con alcohol-acetona, gota a gota.

En este paso, el mordente es eliminado con el solvente en las gramnegativas.

Las grampositivas, conservan el mordente. (cristal violeta-lugol)

Las clulas gramnegativas, no conservan el mordente, por lo tanto quedan incoloras, las clulas grampositivas quedan color azul-violeta al conservar el mordente en su interior.

Para observar a las cl. Gramnegativas que quedaron incoloras, se aade safranina, (colorante de contraste), para teirlas de rojo, se deja un minuto y se lava con agua.

Introduccin a las tinciones

Tincin Gram Tincin de Cpsula Tincin de Esporas Tincin Acido-Resistente _ Tincin Negativa

Preparado por: Kary Bouet

Objetivos

Conocer las ventajas de la tincin de microrganismos Conocer el mecanismo bsico de una tincin Aprender las destrezas del proceso de preparacin de frotis y de diferentes tinciones: Gram, cido-resistente, esporas y cpsula Establecer las diferencias entre bacterias basadas en las tinciones

Introduccin a las coloraciones

Tinte = cromgeno + auxcromo Cromgeno= Benceno (solvente orgnico) + cromforo (grupo que provee las propiedades de color) Auxcromo- grupo qumico que se ioniza con el cromgeno y forma sales que se pegan a las fibras y tejidos.

Tipos de tintes

Bsicos- Tienen carga catinica. La porcin del cromgeno tiene carga positiva y poseen gran afinidad por los componentes celulares negativos. Estos tintes son los ms utilizados debido a que las bacterias tienen una superficie con carga negativa.

Ejemplo: Azul de metileno, cristal violeta y carbolfucsina

Tipos de tintes (cont.)

Acdicos- Tienen carga aninica. La porcin del cromgeno es negativa y tienen gran afinidad por los componentes celulares positivos. Las sales de sodio, potasio, calcio o amoniaco de cidos con color son ionizados para producir un cromgeno con carga negativa.

Tincin simple

Utilizado para observar el tamao, arreglo y forma. Se utiliza un solo tinte.

tincin directa- se tie a la bacteria. Tincin negativa- tie el fondo pero no a la bacteria

Tincin diferencial

Tincin diferencial- es una gran herramienta para separar y clasificar los microorganismos observados de acuerdo a sus caractersticas. Es mayormente utilizada para visualizar las estructuras como los flagelos, cpsulas y esporas. Para ser clasificado como tincin diferencial debe tener al menos tres tintes Ejemplo- Tincin Gram

Tincin GRAM

Tinte primario- cristal violeta, tie la bacteria de color violeta Agente mordante- Yodo- forma un complejo insoluble con cristal violeta. Ayuda a adherir el tinte a la clula. Ayuda a resistir la decoloracin Agente decolorizante- alcohol etlico al 95%, el cual sirve como solvente de lpidos y agente deshidratante de protenas. Contratinte-safranina-tie de rojo a la bacteria

Resultados de Gram

Preparacin del frotis:

Limpiar la laminilla con papel de lentes. Prepara el frotis Medio lquido- solo se coloca una porcin del cultivo con el loop en la laminilla. (Agitar) Medio slido- se coloca una gotita de agua destilada en la laminilla y se diluye la porcin de cultivo en ella. Se esparce bien. Secar a temperatura ambiente Fijacin por calor

Preparacin de la tincin Gram

Preparacin del frotis Cristal violeta (30 segundos - 1minuto) Lavar con agua Yodo (1 minuto) Lavar con agua Alcohol etlico al 95% suavemente Lavar con agua Safranina (45 segundos) Lavar con agua Secar con bibolous paper

Tincin Acido-Resistente

Las familias Mycobacteriae y Nocardiaceae son cido resistente. Los microorganismos cido-resistentes se caracterizan por tener una pared celular gruesa de cera (lipoidal) que contiene cido miclico. Los organismos que son decolorizados por el alcohol cido no son cido resistente.

Tincin Acido-Resistente

Tinte primario- Carbolfucsina-tinte rojo fenlico (5%). Puede penetrar la pared

Agente decolorizante- alcohol cido (3% HCl +95% alcohol etlico) Contraste-Azul de metileno- se utiliza para teir de azul las bacterias que quedaron incoloras

Preparar un frotis Carbolfucsina (3 minutos) Utilizar un papel toalla bien impregnado del reactivo. Lavar con agua Decolorizar con alcohol etlico Lavar con agua Azul de metileno por 2 minutos Lavar con agua Secar con bibolous paper

Preparacin de la tincin cido-resistente

Tincin de esporas Mtodo de Schaffer-Fulton

Clula vegetativa- forma metablicamente activa = bacterias

Esporas- forma metablicamente inactiva y altamente resistente Los miembros del gnero anaerobio Clostridium, Desulfotomaculum y Bacillus pueden existir metablicamente activos o inactivos.

Formacin de esporas como mtodo de sobrevivencia

Condiciones ambientales hostiles, ocurre esporognesis la cual forma la espora Condiciones ambientales favorables, ocurre germinacin, lo cual forma la clula vegetativa

Tincin de esporas

Tinte primario-Verde Malaquita- Requiere calor para la penetracin de este tinte. Agente decolorizante- Agua- remueve el exceso de tinte, decoloriza la clula vegetativa Contraste-Safranina- Tie las clulas vegetativas

Preparacin de la tincin de esporas

Preparar el frotis Verde Malaquita (2-3 minutos) en calor Dejar enfriar la laminilla y enjuagar con agua Safranina (30 segundos) Lavar con agua Secar con bibulous paper

Tincin de cpsula

Cpsula-estructura gelatinosa secretada por algunas bacterias Las clulas que tienen cpsula son virulentas y causan enfermedades ya que protegen a la clula de la accin fagoctica del hospedero. La mayora de las cpsulas estn compuestas de polisacridos, por lo que son solubles en agua.

Tincin de cpsula

Tinte primario- Cristal Violeta 1%- tie todo el frotis color oscuro Decolorizante y Contraste- Sulfato de Cobre 20%-se usa para enjuagar el tinte primario

No se enjuaga con agua por que la cpsula es soluble en agua.- funcin de decolorizante El CuSO4 es absorbido en el material de la cpsula que ha sido decolorizada - funcin de contratinte

Preparacin de tincin de cpsula

Preparacin de un frotis cargado (heavy) Dejar secar a temperatura ambiente Cristal violeta 1% (5-7 minutos) Enjuagar con CuSO4 Secar con bibulous paper

Tincin negativa

Ideal para poder observar la estructura de la cpsula La tincin se logra mediante una mezcla del tinte y el cultivo de bacteria El tinte utilizado es India Ink Se le conoce como efecto de cielo estrellado

Pasos a seguir para tincin negativa de cpsula

Referencias: Laboratory Excercises in Microbiology, Harley & Prescott, Fourth

& Fifth Edition