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Utilizzo degli anticorpi nella

ricerca di base
WESTERN BLOT
E’ una tecnica che permette di evidenziare la presenza di una
proteina in una linea cellulare o tessuto, utilizzando un sistema di
rivelazione che prevede l’utilizzo di anticorpi

Dalle cellule o dai tessuti vengono estratte le proteine totali (ma si


possono anche ottenere preparazioni più specifiche, es. proteine di
membrana o nucleari), vengono bollite in presenza di SDS e β-
mercaptoetanolo, e separate mediante elettroforesi su gel di
acrilamide/bis.

Le proteine, sfruttando sempre la loro carica negativa conferita


dall’SDS, vengono trasportate elettroforeticamente
(BLOTTING) su una membrana di nitrocellulosa ove si fissano.
La membrana viene successivamente incubata con l’anticorpo
specifico per la proteina che vogliamo mettere in evidenza

Seguono lavaggi che mi rimuovono gli anticorpi che non si sono


legati in modo specifico all’antigene (che possono anche essere la
totalità qualora l’antigene non sia espresso in quella linea cellulare
o in quel tessuto)

La membrana viene incubata con l’anticorpo secondario


perossidato: se presente, si lega al primario

In camera oscura: dopo una breve incubazione con il substrato


della perossidasi (luminolo), la membrana viene messa a contatto
con una lastra fotografica. La perossidasi, nella reazione di
ossidazione di una molecola di luminolo, emette una radiazione
luminosa che impressiona la lastra in quel punto
La lastra fotografica viene successivamente posta in una
bacinella contenente sviluppo, e poi in un’altra contenente
fissativo
IMMUNOPRECIPITAZIONE
Ulteriori tecniche di laboratorio che si
basano sul legame antigene-anticorpo
sono:
METODI IMMUNOCHIMICI DIRETTI

Anticorpo primario specifico per la


proteina di interesse

Cellule fissate
METODI IMMUNOCHIMICI INDIRETTI

Anticorpo secondario specie-


specifico

Anticorpo primario specifico per


la proteina di interesse

Cellule fissate
IMMUNOISTOCHIMICA
(immunocitochimica)
IMMUNOFLUORESCENZA

Marcatura a livello della Marcatura a livello


membrana cellulare citoplasmatico
PRODUZIONE DI ANTIGENI
PER L’IMMUNIZZAZIONE
Reazione a catena della polimerasi
(PCR)
Permette di amplificare il DNA di un gene o parte di
esso, ottenendone un numero di copie tale da essere
visibile in un gel di agarosio.

Materiale occorrente:
•2 Primers gene specifici: sequenze di 17-35 basi
complementari alla sequenza nucleotidica del gene (parte
di esso) di interesse, uno all’inizio, l’altro alla fine.
Vengono riconosciuti dall’enzima polimerasi
•L’enzima POLIMERASI (DNA polimerasi DNA-
dipendente)
•Un termociclizzatore
Ogni ciclo avviene a tre diverse temperature, ad ognuna delle
quali corrisponde un evento:

• DENATURAZIONE (92-98°C): la molecola del DNA si


denatura, ossia i due filamenti complementari si staccano
• ALLINEAMENTO (42-64°C): i filamenti tendono a riunirsi
ma, essendo presenti in grande quantità ed essendo più piccoli,
i primers si legano più rapidamente alla sequenze bersaglio
• ALLUNGAMENTO (68-72°C): è la temperatura ottimale per
la funzione della polimerasi, che, partendo dai primers,
sintetizza DNA basandosi sul DNA stampo a singola elica
Reazione a
catena
della Polimerasi
(PCR)
cDNA
MCS

Promotore regolabile
(inducibile)

cDNA
5’ 3’
MCS
P

Proteina ricombinante NH2 COOH


Trasformazione del plasmide
ricombinante all’interno di cellule
batteriche
….inoltre
-PER EVITARE LA DEGRADAZIONE DI PROTEINE ETEROLOGHE E
PER PERMETTERNE LA PURIFICAZIONE QUESTE VENGONO
PRODOTTE COME PROTEINE DI FUSIONE CON UNA PROTEINA
STABILE DELL’ORGANISMO OSPITE.
- I DUE cDNA DEVONO ESSERE FUSI MANTENENDO LA CORRETTA
GRIGLIA DI LETTURA
cDNA di interesse
MCS
GST

PROMOTORE P
REGOLABILE

Proteina di fusione
Ai batteri in crescita in terreno di coltura viene
aggiunto l’induttore (IPTG)…….
g e n e d a n o i in s e rito
G ST

T R A D U Z IO N E
G ST

P ro te in a c o d ific a ta d a l
g e n e d a n o i in s e rito
G S T (p ro te in a )
….. I batteri vengono poi lisati mediante l’uso di ultrasuoni
(SONICAZIONE).
Per separare le proteine di fusione da tutte le altre proteine
batteriche che non ci interessano sfruttiamo la capacità della
GST di legare il suo substrato naturale, ossia il glutatione.
Quest’ultimo viene fornito anche legato covalentemente a
palline di Sefarosio (Glutatione Sefarosio 4B).
La proteina “fusa” può servire a purificare la proteina ricombinante:
Promotore
“inducibile”
GST GST
Proteina di fusione

Proteina di interesse
pMAL

cDNA
di interesse
-

Sefarosio

con legato
glutatione

Eluizione

Proteina di fusione purificata


M o le c o la d i g lu ta tio n e

G L U T A T IO N E
S E FA R O S IO 4B
M o le c o la d i g lu ta tio n e
n o n le g a te a s e fa ro s io

M o le c o la d i g lu ta tio n e

G L U T A T IO N E
S E FA R O S IO 4B

L e m o le c o le d i g lu ta tio n e lib e re c o m p e to n o
c o n q u e lle le g a te a l s e fa ro s io p e r il le g a m e c o n
le p ro te in e d i fu s io n e , d e te rm in a n d o n e il
p ro g re s s iv o d is ta c c a m e n to .
P R O T E IN A D I F U S IO N E
Gel di proteine colorato con
Blu di Comassie
Risposta
Il sangue viene centrifugato
TEST ELISA