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LE REAZIONI AL BUIO:

BUIO
assimilazione fotosintetica del carbonio → il Ciclo di Calvin

“funzione”
della FS

Bilancio delle “entrate” e delle “uscite” fra fotosintesi e respirazione:


la fotosintesi e la respirazione sono due processi complementari
e la “comunicazione” fra loro avviene proprio attraverso gli “zuccheri”
Relazioni fra Fase Luminosa e Fase Oscura:

La Fase Luminosa produce NADPH


e ATP che vengono consumati e
riportati a NADP+, ADP e Pi dalla
Fase Oscura in cui la CO2 è ridotta
a zuccheri C(H2O)n.
Il ciclo catalitico della fissazione
della CO2 (ciclo di Calvin,
Calvin ciclo C3
o ciclo riduttivo dei pentosi fosfati)
fosfati
si compie principalmente
in 3 tappe:
tappe

- CARBOSSILAZIONE
- RIDUZIONE
- RIGENERAZIONE

e necessita di
- CO2
- UN ACCETTORE DELLA CO2
- NADPH
- ATP.
L’enzima capace di fissare la CO2 su un accettore è la RUBISCO
Ribulosio 1-5 difosfato carbossilasi-ossigenasi
(ponte fra il non-vivente ed il vivente)
L’enzima Rubisco è composto da 8 subunità
grandi (L, arancio e giallo), codificate dal
genoma plastidiale, e 8 subunità piccole (S,
blu e viola), codificate dal genoma nucleare:
L8S8.
L8S8
Vi sono 8 siti catalitici che lavorano
indipendentemente l’uno dall’altro e che sono
posti alle interfaccia fra le subunità L.
Le subunità S hanno invece ruolo regolativo.

La rubisco dei batteri


fotosintetici ha le stesse
proprietà catalitiche di quella
delle piante, ma è composta
L solo da 2 subunità
(piante: ragioni di “spazio”?)
S
Il SITO CATALITICO della Rubisco è organizzato attorno ad uno ione Mg2+
(verde) coordinato da 3 aminoacidi fra cui una lisina carbamilata (cioè con una CO2 legata
all’NH2 terminale, nella figura è in basso, mentre la CO2 in alto è quella già legata allo zucchero

bisfosfato). Il carbammato viene stabilizzato dal Mg2+ stesso.


Reazione di carbamilazione:

-CH2-NH2 + CO2 → -CH2-NH-CO-OH

OH
CO2
E – lys – N – C
zucchero2P O
H

Folding adeguato per la forma attiva


dell’enzima:
carbamilazione + Mg2+
(anche Rubisco Chaperone)
SCHEMATIZZAZIONE DEL SITO ATTIVO DELLA RUBISCO

Il Mg2+ è positivo e quindi


può coordinare varie
molecole che presentano CO2 e RuBP
delle parziali cariche
negative, quali appunto Mg2+

CO2, RuBP,il
RuBP carbammato
HO O
ed altri due aminoacidi C
opportuni. NH

Residuo di lisina
carbamilato

Catena aminoacidica
della proteina
Quando il sito catalitico è costituito e
quindi l’enzima è in forma attiva, vi si
lega il ribulosio 1-5 bisfosfato (RuBP):
l’enzima si chiude adesso su se stesso ed
espelle le molecole d’acqua dal sito attivo
fuorché quella legata al sito attivo stesso e
Forma attiva della rubisco con il
necessaria per la catalisi. substrato legato (solo subunità L)

Alcune informazioni sulla RUBISCO:


A dispetto del suo ruolo centrale nella fotosintesi, la rubisco è un enzima molto lento:
lento
carbossila solo tre molecole al secondo! (1000-100000 come range medio e generico di attività di
altri enzimi).
La cellula supplisce a ciò aumentando le copie di enzima: è la proteina più abbondante
sulla terra.
Inoltre è anche poco specifica:
specifica il sito di legame per la CO2 può legare anche l’O2 (con
rapporto di frequenza 3:1): ossigenazione e fotorespirazione.
In pratica l’enzima può legare anche O2 al substrato (il RuBP) invece che solo CO2.
LA REAZIONE DI FISSAZIONE DELLA CO2:
LA CARBOSSILAZIONE DEL RuBP
La Rubisco catalizza l’addizione di 1 CO2 sul RuBP (5C) con formazione di un
composto intermedio instabile (6C) che per idrolisi dà 2 molecole di 3-
fosfoglicerato (2 x 3C = 6C).
C6 2 C3
C5

Il processo avviene in 3 TAPPE PRINCIPALI


I° TAPPA:
Enolizzazione
ovvero passaggio del RuBP dalla forma
chetonica alla forma enolica

La sottrazione di H+ di C3 dal RuBP


forma un intermedio enediolico
L’effetto polarizzante di Mg2+ e la
vicinanza di un O carbaminico
posizionato per accettare H+ è favorevole
P per la formazione dell’enediolo C2-C3,
C2-C3
stabilizzato anche dalla protonazione
CO2
dell’O di C2.
P L’O carbaminico è l’accettore iniziale di
H+ di C3, ciò implica che la catalisi è
iniziata dall’effetto combinato di
H+ polarizzazione del Mg2+ del carbonile di
O Carmaminico C2 del RuBP e di riduzione del pKa del
C3 e del carbammato che accetta H+ di
C3.
La conformazione del sito attivo
favorisce l’intermedio enediolo /
carbanione e assiste la reazione.
II° TAPPA: Carbossilazione e idratazione
ovvero addizione di una CO2 e di un H2O sul RuBP in forma enolica

Il Mg2+ stabilizza il 2, 3 enediolo coordinandone i gruppi idrossilici. Il Mg2+ coordina anche


un O della CO2 che deve essere legata: in tal modo la CO2 viene mantenuta in una posizione
favorevole per la reazione di attacco elettrofilo con il C2 del RuBP enediolo che nel
frattempo è divenuto un nucleofilo: la CO2 è un elettrofilo ed il C2 dell’enediolo è ricco di
elettroni! Il C2 della forma chetonica lo sarebbe stato molto meno!
Quando l’enzima è chiuso sull’intermedio, solo piccole molecole come CO2 e O2 possono
raggiungere l’enediolo.
Avviene poi la reazione di addizione di H2O che produce la forma idratata dell’intermedio a 6
atomi di C 2'-carbossi, 3-cheto arabinitolo 1,5-bisfosfato: instabile!
III° TAPPA: Rottura del legame C-C
ovvero produzione delle due molecole di PGA

Una volta che la carbossilazione e l’idratazione dei prodotti è avvenuta, l’intermedio


carbossilato instabile si divide in due molecole (il legame fra il C2 ed il C3 è molto
destabilizzato!).
La prima molecola di 3-fosfoglicerato (PGA) originatasi dalla metà inferiore
dell’intermedio può ora essere rilasciata.
La rottura del legame C2-C3 è il segnale per il sito attivo di aprirsi. I tre C superiori sono
nella forma di carbanione che deve essere protonato per generare il secondo PGA.
Il rilascio della seconda molecola lascia il sito aperto e disposto a legare un altro
substrato.
ATTIVAZIONE, REGOLAZIONE ed
INIBIZIONE della RUBISCO
Attivazione:
Per funzionare, la Rubisco deve essere convertita nella sua forma attiva.

Deve quindi avvenire la carbamilazione della Lys, il carbammato poi coordina il Mg2+ ed
il sito catalitico si attiva.

La carbamilazione e la decarbamilazione sono rapide e spontanee.

L’attivazione della Rubisco implica un cambiamento conformazionale di L stabilizzato dal


Mg2+. In questa forma, la Rubisco può legare il RuBP in modo tale da catalizzare la
carbossilazione (o ossigenazione).

La forma non carbamilata è inattiva, lega saldamente il RuBP senza poterlo


processare.
La carbamilazione ed il legame con il Mg2+ sono favoriti dalla LUCE.

H+ H+
E E CO2 E Mg2+ E

lys lys lys lys


H+ H+ Mg2+
NH3+ NH2 NH NH

Durante la carbamilazione vengono liberati 2 H+! COO- COO-

Come può questo tipo di reazione di attivazione della Rubisco “accoppiarsi”


Mg2+
con le variazioni luce dipendenti del pH dello stroma del cloroplasto?
….è sempre qualcosa del tipo “legge dell’azione di massa” che guida qualunque reazione,
quelle dei sistemi biologici comprese!
L’attivazione prevede liberazione di H+, sarà quindi stimolata da un aumento del pH
stromatico che avviene proprio di giorno durante il trasporto fotosintetico degli e-.
Inoltre, la [Mg2+] aumenta nello stroma proprio durante la fase luminosa per il bilanciamento
di carica: la formazione del complesso attivo con il Mg2+ è quindi favorita di giorno.
La Rubisco viene attivata durante il giorno proprio quando sono disponibili NADPH e ATP per
il ciclo di Calvin………. Ma quale fase oscura?
Se la Rubisco non è carbamilata, lega saldamente il RuBP e non lo processa → notte.
In tali condizioni, quando l’enzima dovrebbe cominciare a lavorare (all’alba!), la
carbamilazione non potrebbe avvenire.
Per essere attivata, la Rubisco richiede l’intervento dell’enzima RUBISCO ATTIVASI:
ATTIVASI
la RA promuove la carbamilazione della Lys, il carbammato poi coordina il Mg2+ ed il
sito catalitico si attiva.
La Rubisco Attivasi lavora permettendo il rilascio del RuBP dalla forma inattiva
della Rubisco promuovendo in tal modo la carbamilazione dell’enzima libero.
La RA per funzionare ha bisogno di ATP…..

NOTTE:
basso NADPH RUBISCO ATTIVASI inattiva, non vi è ATP disponibile
basso ATP basso Mg2+
Normale pH RUBISCO inattiva non è favorita la carbamilazione,
quindi legame a RuBP inattivante
GIORNO:
Trasporto degli e-
alto NADPH La RUBISCO ATTIVASI può cominciare
alto ATP a lavorare…….
alto Mg2+
alto pH
Schema per la conversione della Rubisco dalla forma inattiva a quella attiva grazie
alla rubisco attivasi che prevede l’unfolding di alcune regioni a loop della rubisco.

Una domanda…..

Ma perché di notte la Rubisco non è bene che funzioni?

Di notte non sono disponibili NADPH e ATP per la riduzione del carbonio fissato,
il ciclo di Calvin quindi non procederebbe e si accumulerebbe PGA…..che è tossico
(è un acido e sarebbe anche osmoticamente attivo!)
Rubisco Attivasi
Interazione, idrolisi
ATP e cambiamenti
ATP conformazionali

ATP
ADP + P
ADP + P

RuBP
RuBP
RuBP -CO2
RuBP RuBP
CO2-
Rubisco
inattiva RuBP

Carbamilazione, Rubisco attiva


L’attività della rubisco è strettamente connessa con alto Mg2+ e alto pH
la presenza della luce. Viene favorita la carbamilazione e
quindi l’attivazione
Ma quale fase oscura?
RIDUZIONE DEL CARBONIO
La reazione di fissazione della CO2 ha prodotto due molecole di 3-fosfoglicerato, ma
questo composto è solo un acido organico e non presenta la tipica funzione aldeidica (o
chetonica) degli zuccheri dove il carbonio si trova in forma ridotta (energia!).
Quindi il passo successivo per la formazione degli zuccheri è la riduzione di tale
molecola al carboidrato corrispondente, che è alla gliceraldeide-3-fosfato.
RIDUZIONE DEL 3PGA:
1) Attivazione del 3PGA tramite fosforilazione
Destabilizzazione della molecola e consumo di ATP
2) Riduzione dell’1-3PGA a G3P: energia luminosa → energia chimica stabile
Utilizzo di NADPH, liberazione di un P, da ac. carbossilico ad aldeide!!

Il primo
zucchero
formato!
La G3P entra adesso nel Ciclo di Calvin per rigenerare l’accettore della CO2, cioè
il RuBP…..
RuBP Ci deve però anche essere un guadagno in termini di zuccheri, quindi:

più precisamente, ogni tre molecole di RuBP che vengono carbossilate (3C5 +
3CO2) e poi ridotte, si formano sei molecole di G3P (6C3),

di queste, cinque entrano nel CICLO DI CALVIN (5C3) per permettere la


rigenerazione del RuBP (3C5) e quindi il procedere stesso delle reazioni di
fissazione e riduzione del carbonio, mentre una (1C3) rappresenta il guadagno in
carbonio ridotto della fotosintesi stessa.

3C5 + 3CO2 → 6C3 → 3C5 + 1C3


Regolette per “ricostruire” il Ciclo di Calvin

Primo:
gli zuccheri possono esistere nella forma aldeidica o nella forma carbonilica (= chetoni)
→ poliidrossialdeidi o poliidrossichetoni.

Esempio: zucchero a 5 atomi di carbonio

aldeide chetone
Regola della U:

Generalmente, quando si
trova una U come 2a vocale,
lo zucchero è un chetone.

Eccezione: fruttosio, diidrossiacetone

Isomeri
Ribosio Ribulosio
strutturali
Poliidrossi → caratteristica delle molecole è la presenza di numerosi gruppi -OH
(idrossido, funzione “dolce”). La loro posizione (a destra o a sinistra) genera gli isomeri
ottici detti anche epimeri.
epimeri
In pratica vi è un gruppo -OH per ogni atomo di C, infatti Cn(H2O)n= (CARBO-IDRATI) !

Molecole
RoS

Xilulosio Epimeri Ribulosio


o
Isomeri ottici

Molecole chirali, “speculari”: un atomo di C asimmetrico con 4 sostituenti diversi.


Secondo:

Reazione di condensazione aldolica → addizione di uno ione enolato alle aldeidi e


chetoni.

Questa reazione avviene solo con aldeidi che hanno idrogeni in posizione α.
Il carbonio del gruppo aldeidico, richiamando elettroni dal gruppo alchilico adiacente,
rende infatti mobile (debolmente acido) un H di questo gruppo. La mobilità degli
idrogeni in α è favorita dall'ambiente alcalino. Inoltre, il carbanione corrispondente è
stabilizzato per risonanza:

H+ H+
Carbanione
Carbonio α
Questo carbanione può reagire con un'altra molecola di aldeide (o chetone) attraverso
un attacco nucleofilo del suo carbonio α al carbonio aldeidico dell'aldeide (o
carbonilico nel caso di un chetone) in quanto povero di elettroni: si formano prima lo
ione alcossido e poi per protonazione l’aldolo.

Sebbene la condensazione aldolica sia perfettamente reversibile, l'equilibrio della


reazione è fortemente spostato a destra, poiché l'acqua è un acido più forte dell'aldolo e
lo ione alcossido è una base più forte di OH-.
Il Ciclo di Calvin sfrutta reazioni di questo genere per unire zuccheri oppure spostare
frammenti a 2 atomi di carbonio fra uno zucchero ed un altro.

Tutto questo al fine di:

rimaneggiare i carboni presenti in 5 molecole di gliceraldeide3P (= 15 C) in 3


molecole di ribulosio3P (= 15 C) per rigenerare l’accettore iniziale della CO2 e
permettere al Ciclo di Calvin stesso di procedere.
Terzo:

Gli enzimi del Ciclo di Calvin

ALDOLASI:
Attraverso la reazione di condensazione aldolica, condensano un C3 aldeide o chetone
su un’altra molecola di zucchero, rispettivamente chetone o aldeide. Lo zucchero che
si forma è in genere un chetone. Adeide + Chetone = Chetone!

TRANSCHETOLASI:
spostano un frammento C2 da uno zucchero ad un altro.
Più precisamente, questi enzimi fanno una condensazione aldolica sui generis,
spostando un C2 da un chetone e condensandolo su una aldeide (con una precisa
stereochimica R o S), lasciando come aldeide lo zucchero donatore e come chetone il
ricevente.

Nelle reazioni catalizzate da aldolasi e transchetolasi reagiscono sempre una aldeide ed un


chetone per formare sempre come prodotti una aldeide ed un chetone con un differente
numero di C.
Nel caso specifico delle aldolasi si forma sempre un chetone con un numero di C pari alla
somma dei reagenti.
FOSFATASI:
i prodotti della condensazione aldolica operata dalle aldolasi formano sempre zuccheri
con 2 gruppi fosfato uno in prima ed uno in ultima posizione derivanti dai gruppi P dei
reagenti stessi (per altro in tal modo attivati: zuccheriP).
Uno zucchero con un P legato al C in C1 non può essere riconosciuto da aldolasi e
transchetolasi e quindi non può essere “rimaneggiato”. E’ necessaria la
defosforilazione del C1 con idrolisi del legame estere del P per permettere allo
zucchero di avere l’estremità libera per l’azione degli enzimi ed al ciclo di continuare.
Quindi, dopo ogni condensazione aldolica segue sempre una defosforilazione.

CHINASI:
fosforilano il substrato a spese di ATP (legame estere!)

EPIMERASI:
cambiano la chiralità delle molecole: R o S.

ISOMERASI:
cambiano la funzione delle molecole: aldeide o chetone

Con tutte queste regole e con tali enzimi, i passi del Ciclo di Calvin diventano “obbligatori”!
Partenza del Ciclo di Calvin:
5C3 sotto forma di G3P da “rimaneggiare” fra loro.

♣ Per poter unire due zuccheri (reazione di condensazione aldolica) vi è bisogno di un


chetone e di un’aldeide, allora isomerizzazione della G3P a DHAP attraverso una
opportuna isomerasi:
♣ Il passo successivo non può che essere la condensazione aldolica dei due C3:

G3P + DHAP → F1-6BP ALDOLASI

♣ Si forma così il fruttosio 1-6 bisfosfato (chetone!), che deve essere “liberato”:

F1-6BP → F6P + P FOSFATASI

♣ Il fruttosio (chetone) può cedere un C2 ad una aldeide:

F6P + G3P → E4P + XIL5P TRANSCHETOLASI

♣ Si formano una aldeide C4 (eritrosio 4P) ed un chetone C5 (xilulosio 5P). Quest’ultimo è


un epimero del ribulosio: è già stato ricostruito un C5.

XIL5P → RuB5P EPIMERASI

♣ Ripartendo dall’E4P, la reazione successiva non può che essere una condensazione aldolica
con un chetone

E4P + DHAP → SED1-7BP ALDOLASI sed = sedum


♣ Si forma il sedeptulosio 1-7BP (chetone), che a sua volta deve essere “liberato”

SED1-7BP → SED7P + P FOSFATASI

♣ Il SED7P (chetone) può cedere un C2 ad una aldeide formando una aldeide ed un chetone

S7P + G3P → RIB5P + XIL5P TRANSCHETOLASI

♣ Lo xilulosio segue la stessa epimerizzazione di prima, mentre il ribosio va incontro ad


una isomerizzazione strutturale da aldeide a chetone

RIB5P → RuB5P ISOMERASI

♣ L’ultima tappa è la fosforilazione in C1 per ricreare l’accettore attivato della CO2 e


chiudere il ciclo (spesa di ATP)

RUB5P + ATP → RuB1-5BP + ADP CHINASI


SCHEMA DEL CICLO DI CALVIN
SCHEMA

DEL

CICLO

DI CALVIN

Tre molecole di
ribulosio 1.5 P
generano il guadagno
di una molecola di
aldeide 3 P glicerica
Riassumendo….. 1) Fissazione

3) Rigenerazione 2) Riduzione

Spesa energetica:
guadagno
Per ogni molecola di CO2 fissata 3ATP e 2NADPH (dalla fase luminosa!!!)
REGOLAZIONE DEL CICLO DI CALVIN
Diversi fattori concorrono alla regolazione dell’attività degli enzimi del Ciclo di Calvin.
Calvin

I) Movimenti ionici dipendenti dalla luce

Durante la fase luminosa: H+ dentro i tilacoidi e Mg2+ (e K+) fuori

- Mg2+ e Rubisco: stabilizzazione del carbammato e costituzione del sito attivo

- Da pH 7 a pH 8: attivazione della Rubisco per carbamilazione oltre ad attività


ottimale di enzimi tipo F1-6BP e fosforibulochinasi

II) Disponibilità di ATP e attivazione della Rubisco Attivasi

- Solo durante il giorno è disponibile ATP (dalla fase luminosa) e quindi solo durate
tale condizione la Rubisco Attivasi può lavorare e attivare la Rubisco stessa.
Abbiamo già precedentemente osservato che il SITO CATALITICO della Rubisco è

organizzato attorno ad uno ione Mg2+ (verde) coordinato da 3 aminoacidi fra cui una
lisina carbamilata (cioè con una CO2 legata all’NH2 terminale, nella figura è in basso, mentre la CO2
in alto è quella già legata allo zucchero bisfosfato). Il carbammato viene stabilizzato dal Mg2+

stesso.
Reazione di carbamilazione:

-CH2-NH2 + CO2 → -CH2-NH-CO-OH

OH
E – lys – N – C
O
H

Folding adeguato per la forma attiva


dell’enzima:
carbamilazione + Mg2+
(anche Rubisco Chaperone)
III) Riduzione dei gruppi –SH dipendente dalla luce

Stato di ossidazione delle proteine e loro attività catalitica ossigeno

- G3P deidrogenasi
- F1-6P fosfatasi
- S1-7BP fosfatasi
- Fosforibulochinasi
- ATP sintasi

Nella sequenza degli AA di queste proteine


vi sono due Cys (-SH) vicine e questi enzimi riducente con
gruppi sulfidrilici
sono attivi solo quando tali –SH sono in
forma ridotta e non ossidati e legati fra loro con un -S-S-.

Come funziona questo sistema?


Durante il giorno, a livello del PSI si ha la riduzione della Ferrodossina, piccola
proteina con centri Fe-S che cede poi l’e- all’FNR per la riduzione del NADP+.

La Fd può avere anche altri substrati, fra cui l’enzima

Ferrodossina:tioredossina reduttasi (con Fe4-S4)

che a sua volta può ridurre una particolare proteina detta Tioredossina.

La Tioredossina è una piccola proteina solubile con due –SH vicini che può quindi
esistere sia in forma ridotta (attiva) che in forma ossidata (inattiva):

-Trp-Cys-Gly-Pro-Cys-

e nella sua forma ridotta riduce gli enzimi del Ciclo di Calvin in questione
attivandoli.
Da segnale luminoso

a segnale sulfidrilico

attraverso l’enzima

FD:TRX REDUTTASI

La tioredossina e gli enzimi


bersaglio sono poi riossidati, e
quindi disattivati, al buio
dall’ossigeno.
Quindi,
che senso ha parlare di fase oscura???

Il Ciclo di Calvin senza la luce non può procedere:

- Rubisco (e gli altri enzimi con pH 8)

- Tioredossine

- ATP e NADPH

Autoregolazione del ciclo di Calvin stesso.

perché….

Prevenzione dell’accumulo notturno di 3PGA

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