Universidad Nacional

“Pedro Ruiz Gallo”

Microbiología Industrial
Biodegradación de Petróleo Diesel

Docente: MSc. Carmen Carreño Farfán

Alumno : Rómulo Aycachi Inga.

Lambayeque – Marzo 2007

Biodegradación de
Petróleo Diesel
Rómulo Aycachi Inga
 El crudo de Petróleo
 El crudo de petróleo se caracteriza por ser un líquido
negro, viscoso y con una composición química sumamente
compleja, pudiendo contener miles de compuestos,
básicamente de la familia de los hidrocarburos.
 Los hidrocarburos componen la familia predominante de
compuestos (un 50-98% de la composición), por lo que
constituyen uno de los grupos de contaminantes
ambientales más importantes, tanto por su abundancia,
como por su persistencia en distintos compartimentos
ambientales.
 Mayoritariamente son alcanos de cadena lineal (n-alcanos
o nparafinas), alcanos ramificados (en menor cantidad),
cicloalcanos (o naftenos) y cantidades variables de
hidrocarburos aromáticos.
 Los principales componentes se subdividen
y purifican en distintas fracciones:
 Fracción saturada (n-alcanos, alcanos
ramificados con cadenas alquílicas y las
cicloparafinas),
 Fracción aromática (monoaromáticos,
diaromáticos y hidrocarburos aromáticos
policíclicos (HAPs),
 Fracción de resinas y
 Fracción de asfaltenos que son menos
abundantes y consisten en compuestos más
polares, pudiéndose encontrar hidrocarburos
heterocíclicos, hidrocarburos oxigenados y
agregados de alto peso molecular .
Refinado del crudo de Petróleo
 El refinado pasa por un proceso de destilación,
con la finalidad de eliminar el color y olor, así
como también, los compuestos del azufre.
 Se destila a temperaturas crecientes
obteniendo 4 fracciones principales: gasolina,
queroseno, destilados medios (querosenos,
gasoil, aceites lubricantes) y un residuo.
 Este residuo se destila al vacío obteniéndose
otros aceites lubricantes (más pesados), ceras
y parafinas y betunes asfálticos (alquitranes).
 Durante el proceso de refinado, se eliminan
componentes de la fracción asfalténica (altamente
recalcitrante) lo que implica que los refinados
intermedios (gasoil, fueles, querosenos y también las
gasolinas) sean productos relativamente más
biodegradables que los coques o alquitranes
residuales.
 Así pues, la composición química de la gasolina es
diferente a la del gasoil debido a que se han obtenido
como productos de destilación del petróleo a partir de
diferentes intérvalos de temperatura.
 En la gasolina encontramos como componentes más
abundantes: nbutano, isopentano, pentano, mono y
dimetilpentanos, hexano, BTEX, mono y dimetil
hexanos, trimetilbencenos, metiletilbencenos, y en
menor cantidad los naftalenos, sus mono y dimetilados
y heptano (de menor índice de octanaje).
 Biorremediación del Petróleo Diesel
usando diversos microorganismos

 La biorremediación es la adición de
materiales a ambientes contaminados para
producir una aceleración del proceso natural
de biodegradación.
 La elevada complejidad de la composición del
crudo de petróleo y derivados, implica la existencia
de una amplia capacidad enzimática si se quiere
conseguir una degradación significativa del crudo.
 La mayor parte de los estudios realizados se han
llevado a cabo con cepas bacterianas individuales o
con la combinación de diferentes cepas aisladas.
 En la mayoría de los casos, son degradadoras de
alcanos, debido a que los alcanos son los
componentes más abundantes del crudo de
petróleo. No obstante en algunos casos, estas
cepas tienen la capacidad de oxidar selectivamente
las cadenas alquílicas de ciertos HAPs alquilados,
compuestos abundantes en el crudo.
 La alternativa a la utilización de cepas individuales
es la obtención y utilización de cultivos mixtos, los
cuales pueden ser consorcios definidos y
consorcios no definidos.
 Los consorcios definidos se caracterizan por ser
una combinación de cepas aisladas con
capacidades degradativas conocidas que son
complementarias entre sí.
 Los consorcios no definidos se caracterizan por ser
el resultado de procesos directos de
enriquecimiento a partir de muestras ambientales
con historia previa de contaminación y por lo tanto
no son el resultado de una combinación de cepas
previamente aisladas.
 Biosurfactantes
 Se dice que un soluto es un agente tensoactivo o
surfactante cuando da lugar a un descenso
significativo de la tensión superficial.
 El descenso de la tensión facilita la eliminación de
las partículas de la suciedad de las superficies
sólidas.
 Son moléculas que contienen un segmento
liposoluble (soluble en aceite) y otro hidrosoluble
(soluble en agua o disolventes polares). La
solubilidad parcial tanto en agua como en aceite
permite al surfactante ocupar la interfase.
 Reducen la tensión superficial y las tensiones
interfaciales entre moléculas individuales en la
superficie y la interfase, respectivamente. Tienen
propiedades emulsionantes.
 Atendiendo a estos criterios un biosurfactante sería
una molécula biológica (orgánica) con propiedades
surfactantes o tensoactivas producidas sobre
superficies vivas, mayormente superficies de
células microbianas, o excretados al medio
extracelular.
 Todas las propiedades y usos de los surfactantes
provienen de dos propiedades fundamentales de
estas sustancias: su capacidad de adsorberse a
las interfases y de otra parte su tendencia a
asociarse para formar estructuras organizadas.
Clasificación de los Biosurfactantes
 Naturaleza química
 a) Lípidos
 b) Hidratos de carbono
 c) Aminoácidos
 d) Glucolípidos
 e) Lipopéptidos
Peso molecular
 a) Bajo peso molecular: glicolípidos. El más estudiado
es el rhamnolípido, producido por diversas especies
como Pseudomonas. La función principal de estos
biosurfactantes es reducir la tensión superficial entre
fases (agua-roca).
 b) Alto peso molecular: Suelen ser polisacáridos,
proteínas, lipoproteínas, LPS o mezclas de estos
polímeros. Estos biosurfactantes no son tan eficaces en
cuanto a la reducción de la tensión superficial entre
fases, pero si son buenos emulsionantes. Además se ha
demostrado que son muy eficaces a bajas
concentraciones y poseen una considerable afinidad por
el sustrato. P.Ej. Alasan producido por Acinetobacter
radioresistens.
Carga iónica
 Agentes aniónicos: Contiene generalmente
uno de cuatro grupos polares solubles-
carboxilato, sulfonato, sulfato o fosfato-
combinado con una cadena hidrocarbonada
hidrófoba. Si esa cadena es corta son muy
hidrosolubles y en el caso contrario tendrán
baja hidrosolubilidad y actuaran en sistemas
no acuosos como aceites lubricantes. Se
usan principalmente en la industria de
jabones y detergentes.
 Agentes catiónicos: Están compuestos por
una molécula lipofílica y otra hidrofílica,
consistente de uno o varios grupos amonio
terciarios o cuaternarios. Son utilizados
comúnmente en detergentes, agentes
limpiadores, líquido de lavaplatos,
tratamiento de textiles, como sustancias
activas antimicrobianas y en cosmética.
 Agentes no iónicos: No se disocian en
iones hidratados en medio acuoso. Las
propiedades hidrofílicas son provistas por
hidratación de grupos amido, amino, éter o
hidroxilo.
Otros tipos de surfactantes:
 La combinación en la misma molécula de un
grupo con tendencia aniónica y de un grupo
con tendencia catiónica produce un
surfactante anfotérico, como por ejemplo los
aminoácidos, las betainas o los fosfolípidos.
Según el pH del medio una de las dos
disociaciones prevalece.
 Este tipo de surfactante se usa sólo en
casos particulares debido a su alto costo.
 Utilización de los Biosurfactantes
 Los contaminantes hidrofóbicos presentes en los
hidrocarburos del petróleo, suelos y aguas del
medio ambiente requieren su solubilización antes
de ser degradados por la célula microbiana.
 Los surfactantes pueden aumentar el área de los
materiales hidrofóbicos, como pesticidas en
suelos y agua del medio, aumentándose así su
solubilidad en agua.
 La presencia de biosurfactantes puede aumentar
la degradación microbiana de los contaminantes.
 La habilidad de los biosurfactantes para
emulsionar hidrocarburos mezclados con agua ha
sido ampliamente divulgada.
 Estas propiedades emulsionantes también se ha
demostrado que favorecen la degradación de los
hidrocarburos en el medio ambiente, por tanto los
hacen muy útiles para el control de la
contaminación por vertidos de aceites.
 En la biorremediación en vertidos de petróleo,
estudios recientes han mostrado que se puede
utilizar el poder solubilizante de las micelas para
extraer ciertas sustancias contaminantes aún
cuando su concentración sea extremadamente
baja.
 Función de los biosurfactantes a la hora
de aumentar la biodisponibilidad

 Dispersar el petróleo aumentando la

superficie de contacto.
 Aumenta la biodisponibilidad de compuestos
hidrofóbicos. Serían en este caso sobre todo
los de bajo peso molecular.
 Pueden ayudar a los microorganismos
productores a desprenderse de las gotas de
petróleo una vez se ha agotado la fuente de
hidrocarburo que utilizaba.
Bacterias degradadoras de PD
 Achrornobacter  Lactobacillus
 Acinetobacter  Leumthrix
 Actinomyces  Moraxella
 Alcaligenes  Nocardia
 Arthrobacter  Peptococcus
 Bacillus  Pseudomonas
 Beneckea  Sarcina
 Brevebacterium  Spherotilus
 Coryneformes  Spirillum
 Erwinia  Streptomyces
 Flavobacterium  Vibrio
 Klebsiella  Xanthomyces
Hongos degradadores de PD
 Allescheria  Mucor
 Aspergillus  Oidiodendrum
 Aureobasidium  Paecylomyses
 Botrytis  Phialophora
 Candida  Penicillium
 Cephalosporium  Rhodosporidium
 Cladosporium  Rhodotorula
 Cunninghamella  Saccharomyces
 Debaromyces  Saccharomycopisis
 Fusarium  Scopulariopsis
 Gonytrichum  Sporobolomyces
 Hansenula  Torulopsis
 Helmintrosporium  Trichoderma
 Trichosporon
 También se ha reportado la utilización de dos
especies de camarones en la biodegradación
del petróleo, siendo estos Peanus duorarum y
Peanus aztecuz cuya capacidad de degradar los
hidrocarburos casi en su totalidad van desde los
compuestos de 12 carbonos hasta los
compuestos de 22 carbonos.
 La cantidad y diversidad de los
microorganismos degradadores de petróleo
depende de la exposición de las aguas a estos
hidrocarburos.
 La velocidad de degradación de los compuestos
presentes en el petróleo es como sigue:
HC saturados > aromáticos ligeros > aromáticos
de alto PM > asfaltenos, resinas
PARTE PRÁCTICA
 Tamizar

Muestra: 100 g de
suelo contaminado
con PD
A
50g de
100 mL de caldo BH tamizado
+ 1% PD B
30 ºC x 72 h 10 mL de la
muestra
enriquecida
100 mL de caldo BH A
+ 2% PD
10 mL de la C
30 ºC x 72 h
muestra
enriquecida
A

100 mL de caldo BH
+ 4% PD

30 ºC x 72 h
 Sembrar
Agar BH +
4% PD
30 ºC x 48 h
Tomar una
alícuota de la
muestra
enriquecida C

Seleccionar y
Repicar repicar 3 colonias

> biomasa, > rapidez de

crecimiento

Incubar

Agar BH + 4% de PD
+ TSA 30 ºC x 48 h

Conservar las cepas en

refrigeración
 Tiempo requerido para su
Reactivar
utilización

Incubar

Centrifugar
30 ºC x 24 h

5 mL caldo
nutritivo

3500 rpm x 15 min.

 Lavar sedimento con
SSFE x 2 veces Realizar esto por cada
consecutivas cepa
Eliminar
sobrenadante

1 mL
Inocular de cada cepa
en botellas
Preparar suspensión al Tubo
Nº 3 del NMF (9x108 cel/mL)
Dejamos un tubo con medio
no inoculado como testigo
10 mL caldo BH con 0.2 mL
de resarzurina y 0.1 mL de
PD

Observar diariamente si Incubar a 30 ºC x 5 d. a

cambia de azul a rosado agitación cte. (150 rpm)
brillante

Como se usó púrpura de bromocresol veremos el cambio de

color de lila a amarillo
 Del inóculo preparado al
Tubo Nº 3 del NMF
(9x108 cel/mL)
30 ºC x 3 d. en agitación
Observar y diariamente formación
de burbujas y turbidez del medio
Centrifugar cada uno de los tubos
(2000 rpm)
Tapamos
herméticamente
Calibramos a cero el
espectrofotómetro con el tubo
blanco
1 mL
Inocular en tubos de
dilución con 10 mL de
caldo Extracto de Levadura
+ 0.2 mL de etanol
Incubar
constante (150 rpm)
Tomar el
sobrenadante
(1mL)
9 mL caldo
levadura etanol +
0.2 mL de PD
Agitamos 1 min. hasta
lograr una emulsión
Realizar la conversión de la
Leer absorvancia a absorvancia de cada una de
540 nm las muestras a UAE
Considerar 0.816 de absorvancia como 1
RESULTADOS
Tiempo requerido para la utilización del
PD como fuente de carbono y energía
 DÍAS DE COLOR DE
CEPA pH
VIRAJE VIRAJE

Cepa 01 ---- ---- ----

Cepa 02 5 días Violeta ≥ 6.8

Cepa 03 12 días Amarillo ≤ 5.2

Cuantificación de las Unidades de
Actividad Emulsificante
CEPA UAE
Cepa 01 1.281

Cepa 02 1.353

Cepa 03 1.561
 Identificación de las cepas aisladas
CARACTERISTICAS CEPA 01 CEPA 02 CEPA 03
Bacilos largos,
Bacilos cortos,
delgados,
espora Bacilos medianos
Morfología espora
central no no esporulados
terminal no
deformante
deformante
De a dos o en
Disposición cadenas De a dos Aislados y de a dos
cortas
Tinción Gram Positivo Positivo Negativo
Catalasa Positivo Positivo Positivo
Película, Película,
Película, turbidez y
Crecimiento en caldo turbidez y turbidez y
sedimento
sedimento sedimento
 Reducción de NO3-

O – F glucosa

Rojo de Metilo -
Voges Proskawer + + -
Hidrólisis de almidón + + +
Indol - -
Caldo glucosa + +
Caldo maltosa + +
Hidrólisis de gelatina + +
Pseudomonas
Género Bacillus sp. Bacillus sp.
sp.
GRACIAS POR SU
ATENCIÓN