Novas Perspectivas em Imunohematologia Eritrocitria

III Jornada Brasileira de Hemoterapia Campo Grande, 19 e 20/09/2008

Lilian Castilho, PhD

Hemaglutinao
Mistura de hemcias lavadas com anticorpos anti-eritrocitrios especficos (monoclonal ou policlonal) Algumas especifidades no disponveis ou limitadas Teste com mais de 100 anos (Karl Landsteiner 1901, Nobel Laureate) A rotina de sorologia de grupos sanguneos dirigida para a deteco dos antgenos de grupos sanguneos clinicamente significantes: ABO, RH, KEL, FY, JK e MNS

sta Aloimunizao detectada pela PAI e compatibilidade entre receptor e metodologia possibilitou o desenvolvimento doador a prtica da medicina transfusional durante o sculo XX

Limitae s Falta de reagentes policlonais e monoclonais:

Dificuldades na fenotipagem de doadores e pacientes

Hemaglutinao

Caracterizao dos reagentes de hemcias utilizados na deteco e identificao de anticorpos

Variabilidade de reatividade dos anticorpos monoclonais quando comparados com os policlonais Fraca reatividade de anticorpos clinicamente significantes Falta de um mtodo nico (universal) para deteco e identificao de anticorpos Subjetividade na realizao, leitura e interpretao dos resultados

Hemaglutinao Limitae s

Dificuldades na: fenotipagem de pacientes politransfundidos fenotipagem de hemcias cobertas com IgG identificao de ags variantes identificao de ags de baixa e alta frequncia

Hemaglutinao Limitae s

O que fazer!

Hemaglutinao Limitae s
D homozigoto ou heterozigoto?

A R1r ou R1R0?

Hemaglutinao Limitae s
D fraco ou D parcial?

Hemaglutinao
Limitaes: Reagentes de hemcias
Dificuldade na incluso de clulas homozigotas Limite na incluso e excluso de aloanticorpos
devido a falhas nos painis de hemcias para os ags D, C, c, E, e, Fya, Jka, S e ags de baixa incidncia nos reagentes de triagem

Controle de qualidade de reagentes de hemcias

(determinao de zigozidade para D, Fya, Fyb)

Fenotipagem de grupos sanguneos

Limitaes
Testes e incluso de dados so trabalhosos Nmeros de doadores que podemos fenotipar
Prover sangue antgeno-negativo para pacientes com o anticorpo correspondente Prover sangue fentipo compatvel para pacientes politransfundidos (ex: falciformes)

O especialista da medicina transfusional do futuro ter a sua disposio tcnicas moleculares para identificar gentipos eritrocitrios Jeff McCullough Transfusion 2003,43:823-28, Editorial

Zoom no DNA

Genotipagem!!!
Resultados seguros nas situaes em que a hemaglutinao limitada

Antgenos de grupos sanguneos: produtos de genes

antgenos carreados em protenas so codificados diretamente pelos genes antgenos carboidratos esto sob o controle de genes que codificam glicosiltransferases 28/29 genes identificados polimorfismos de GS definidos ao nvel gentico anlise molecular dos genes de GS pode ser til na clnica entendimento das bases moleculares de GS permitiu explorar suas funes

Aplicaes dos testes moleculares em doadores de

sangue
Genotipagem em larga escala para identificao de antgenos comuns e raros Produo de painis de hemcias complementares Zigozidade D, Fya, Fyb : controle de qualidade de reagentes Determinao de variantes Rh (D fraco, Del, evar ) Prover sangue antgeno-negativo para pacientes com aloanticorpos (ex falciformes)

Aplicaes dos testes moleculares na medicina transfusional

Suporte transfusional de pacientes politransfundidos ou aloimunizados reduzindo ou prevenindo a alomunizao Suporte transfusional de pacientes com teste direto da AGH positivo

Identificao de fentipos raros Identificao de variantes Rh que apresentam risco de aloimunizao Confirmao do gentipo quando um antgeno fracamente expresso Resoluo de discrepncias ABO, RhD

Aplicaes dos testes moleculares na medicina materno-fetal

Me possui anticorpo IgG clinicamente significante Pai heterozigoto para o gene que codifica o antgeno de interesse, ou desconhecido Genotipagem fetal (plasma materno)

Aplicaes dos testes moleculares no controle de qualidade de reagentes de hemcias

Fentipo A D+ Fy(a+b) Fy(ab+) Provvel Gentipo AA, AO RHD/RHD or RHD/ FY*A/FY*A or FY*A/FY or FY*A/FY*X FY*B/FY*B or FY*B/FY or FY*B/FY*X

Testes moleculares utilizados na determinao de alelos de grupos sanguneos

Testes moleculares para anlise de genes de grupos sanguneos

Amplificao do DNA por PCR
PCR-RFLP PCR-alelo-especifico PCR-multiplex

Clonagem e sequenciamento Real time PCR Mtodos automticos Microarray

Genotipagem de grupos sanguneos

Tcnicas atualmente empregadas so trabalhosas e demoradas
AS-PCR e PCR-RFLP requerem

trabalho manual anlise por electroforese (gel de agarose, poliacrilamida) Repeties Diferentes ensaios para a mesma amostra
PCR Real-Time fornece anlise em tubo fechado

trabalho manual

Perspectivas: Microarray

Transfusion Maio 2005

Vol 45

DNA array-Chips
O que um chip de DNA? (um chip uma matrix) Informtica: armazena uma lista de dados ordenados Biologia: Armazena um grupo de molculas DNA ordenadas (PCR, oligonucleotdeos...) em uma superfficie slida (vidro, nylon, lminas de slica)

DNA array-Chips Produo

Oligos colocados em uma superfcie de vidro (50-100 micras, 0.2-0.5 nL) Milhares de sequncias possvel criar novos arranjos em semanas/meses

Perspectivas: Microarray DNA array -Chips

Perspectivas: Microarray DNA array -Chips

Grande nmero de amostras (boa plataforma para doadores de sangue) PCR multiplex Anlise ps-PCR rpida, automtica para numerosos polimorfismos de grupos sanguneos Sistema fechado para prevenir contaminao Anlise computadorizada dos resultados Download direto das interpretaes para a base de dados

DNA array -BLOODchip

Sondas de oligonucleotideos em lminas de vidro (Progenika) ABO, Rh (Cc, D, Ee) Kell, Jk, Fy, Di, Do, Co, MNSs

Protocolo BloodChip
ag agc c ac actgctgct ta acg cg tc tca ag gc ct t
1500bp

MPX II (outros) Cy5 dCTP (MNS; RHCE , DO, KEL, CO, JK, DI, FY)

RHD positivo

DNA Ladder

DNA Ladder

MPX I (ABO e RHD) biotina dUTP

RHD negativo

Controle Negativo PCR c

t gc ct tca ag cg gtc cta tac ctg tgc agagc acac

1000bp 800bp 600bp 500bp 400bp 300bp 250bp 200bp

RHD exon 2 1315bp RHD exon 7 731bp RHD exon 9 525bp RHD exon 8 498bp RHD exon 5 470bp ABO exon 7B 461bp RHD exon 1 415bp ABO exon 6 410bp RHD exon 6 407bp ABO exon 7A 371bp RHD exon 10 360bp RHD exon 4 317bp RHD exon 3 304bp ABO exon 2 217bp ABO exon 4 151bp

Protocolo BloodChip

MPX I (ABO and RHD) Streptavidin Cy3 MPX II (outros) Cy5 dCTP l mutante heterozigoto normal

ABO phenotype of O1vO1v

Anlise dos dados: BloodChip

DNA array -BeadChip

Genotipagem para: C/c, E/e, Kk, MNSs, Jka /Jkb, Fya/Fyb, Dia/Dib, Coa/Cob, Lwa/Lwb, Sc1/Sc2, Lua/Lub Doa/Dob, Hy, Joa, Hgb S Custo competitivo

T M

BioArray Solutions Ltd

Construindo BeadChips...
Bead Functionalization

BioArray Solutions Ltd

4,000 ENCODED BEADS

Bead Synthesis & Encoding

Pooling Array Assembly

BeadChip Wafer

0.3 mm

BeadChipTM -Protocolo
BioArray Solutions Ltd
gDNA

2:00 h
P

1: AMPLIFICAO
Primers

m-PCR

OH

OH OH

2: SELEO DA FITA
REMOO DE PRIMERS E dNTPs

1:30 h

DIGESTION OF P-STRAND

ssDNA
DNA POLYMERASE + dNTPs + labeled dNTP

3: eMAP
TARGET

ANNEALING E EXTENSO

0:30 h

PROBE

CUSTOM BEADCHIP

4: AQUISIO IMAGEM E ANLISE

1:00 h
96 amostras

Discriminao por extenso do alelo-especfico

Assay Image
MATCH T G C T A A C G A T MISMATCH A C G X A C G T T C T A T C A A G A T G
eMAP

DNA Polymerase

G C T A T A C G T A A T G

Aquisio da imagem

BioArray Solutions Ltd

Decoding Image

Automated Snapshot Array Imaging

Assay Image

Anlise dos dados:Gentipos

Anlise do chip

BioArray Solutions Ltd

Anlise do DNA (para cada par de sondas)

SNP = FY - GATA ( FY - 33T>C )

AA

" AB

" BB

BioArray Solutions Ltd

Anlise dos dados:Fentipos

Silencing FY Doa Coa Lub Fyb Lua Fya Sc1 Sc2 Jkb Jka Dib Dia Hy C h ip N a m e S a m p le W a rn M sg Fyx[Fy(b+w) 1 HgbS Jo(a) LWb LWa Dob Cob Cm m nt M C K N + + + + + E S + c e k s + + + + + + + +

H E A 0 4 96 1 _ 1 H E A 0 4 96 1 _ 2 H E A 0 4 96 1 _ 3 H E A 0 4 96 1 _ 4 H E A 0 4 96 1 _ 5 H E A 0 4 96 1 _ 6 H E A 0 4 96 1 _ 7 H E A 0 4 96 1 _ 8

A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8

+ + + + + -

+ + +

+ + + + + + + +

+ -

+ + + + + + + +

+ + + + -

+ + -

+ + + + + + +

+ + + + + + -

+ + + + +

+ -

+ + + + + + + +

+ + + + +

+ + + + + + + +

+ + + + + + + +

+ + + + + + + +

+ + + + + + + +

+ + + + + + + +

+ + + + + + + +

+ + + + + + + +

1 No

- No No + 1 No 2

2 No

- ++ 1 No - No No + 2 No

Uma vez que se tenha kits adequados para genotipagem de pacientes e doadores de sangue, ser possvel realizar a busca eletrnica da unidade de sangue compatvel disponvel no estoque do banco de sangue David Anstee Transfusion 2005,45:650-53, Editorial

Busca de unidades compatveis para pacientes falciformes

DUFFY GATA FY265 DO-793 DO-350 DO323 KELL KIDD GPB GPA LU

14 Pacientes AA AB BB 288 Doadore s AA AB BB

0 5 9

2 4 8

14 0 0

1 8 5

12 2 0

14 0 0

0 1 13

5 6 3

2 4 8

7 4 3

0 1 13

46 88 154

69 81 138

284 4 0

41 153 94

284 4 0

286 2 0

0
4

92 156 40

58 88 142

135 92 61

0 7 28 1

284

Gentipos para 20 SNPs obtidos em 5 hs

Fentipos deduzidos de gentipos de doadores compatveis com os pacientes falciformes

Fentipo ABO/Rh Fentipo deduzido do gentipo Pacientes falciformes Doadores de sangue

O R0r O R0r O R0r B R0r O R2r B R2r O R1r O R1r A R1r O R2R2 O R1R2 O rr

Fy(a-), Do(a-) S-, K-, Jk(b-) Fy(a-), S-, K-, Jk(b-) Fy(a-), Do(a-), KS-, K-, Jk(a-), S-, K-, Jk(b-) Do(a-), KDo(a-), s-, K-, Jk(b-) Do(a-), K-, Jk(b-) S-, KDo(a-), s-, K-, Jk(b-) S-, K-, Jk(b-) K-

2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1

5 3 6 3 4 2 5 4 2 0 2 2

Total

14

38 / 288

Alelos raros encontrados em doadores

DNA array
Gentipos KEL*1/1 GYPB* S-sFY*A/B (265) LU*A/B LU*A/A CO*A/B GYPB* S-sHY 323 T JO 350 T DI*A/B DI*A/A Total Fentipos deduzidos Kk+ SsU Fy(a+bx) Lu(a+b+) Lu(a+b) Co(a+b+) S-s-Uvar HyJo(a) Di(a+b+) Di(a+b) Doadores 1 5 6 6 3 8 2 2 3 9 1 46/1000(4.6%)

Resultados de genotipagem na clnica Caso Clnico-Histrico

Paciente feminina descendente de Asiticos, 56 anos 4 gestaes, transfuses prvias? Paciente em dilise, agendada para cirurgia Solicitado 2 unidades de sangue PAI positiva 2+ em AGH Painel positivo 2+ em AGH com todas as clulas, negativo com DTT Autocontrole negativo

Resultados de genotipagem na clnica Caso Clnico-Genotipagem

Silencing FY
ChipName Sample WarnMsg

Fyx[Fy(b+w)
No No 1

HgbS

Jo(a)

LWb

LWa

Dob

Cob

Doa

Lub

Coa

Fyb

Lua

Sc1

Sc2

Fya

Jkb

Jka

Dib

Dia

Hy

Cmmnt

S
+

HEA04961_1 HEA04961_2 HEA04961_3 HEA04961_4 HEA04961_5

A1 A2 A3 A4 A5

+ + + + +

+ + + + +

+ -

+ + + + +

+ + -

+ + -

+ + + +

+ + + +

+ + + + -

+ + +

s
+ + + + +

+ + + + +

+ + -

+ + + + +

+ + + + +

+ + + + +

+ + + + +

+ + +

+ + + + +

+ + + + +

+ +

No No 1 2

Fentipo da paciente: O, Ro, K-k+, Fy(a-b-), Jk(a+b-), M+N-S-s+, Lu(ab+), Do(a-b+), Hy+, Jo(a+), Di(a+b-), Co(a+b-), Sc1,-2 b

Paciente com anti-Di

Confirmao sorolgica em gel com

Caso Clnico: Concluso

24 polimorfismos de grupos sanguneos em 5hs Identificao de fentipo raro Soros raros preservados Menor custo se comparado ao testes sorolgicos: adsoro, eluio, enzimas, qumicos, fenotipagem)

Tecnologia Microarray permite

Resolver problemas complexos Fornecer unidades de sangue compatveis Encontrar doadores raros Melhorar a qualidade e segurana transfusional
Tecnologia Microarray: potencial para mudar a prtica na medicina transfusional

O fim da sorologia est prximo?

Um gentipo no um fentipo Genotipagem molecular para o complexo RH nem todos os alelos ainda descritos Validao e ensaios clnicos com os chips levaro tempo para assegurar a confiabilidade da genotipagem de grupos sanguneos em larga escala Interpretao de um grupo ABO incorreta pode ser desastrosa Novas mutaes com genes de grupos sanguneos continuaro a surgir e, podem ser necessrias atualizaes dos chips

Um sculo de descobertas: Como ser o novo sculo?

2005 Anlise de grupos sanguneos por microarray

Concluso
Sorologia continuar por um bom tempo (?): ABO Genotipagem um mtodo seguro e pode ser aplicado para determinao de grupos sanguneos Plataformas com mltiplos testes podem ser utilizadas para pesquisa e diagnstico Genotipagem em larga escala pode trazer benefcios para o doador e paciente se adequadamente aplicada

O Futuro: plataforma que pode permitir que cada indivduo tenha seu gentipo de grupos sanguneos, HLA e HPA definidos rapidamente ao nascimento (esta informao acompanhar o indivduo ao longo da vida)

Obrigado pela ateno!