Enzimas Imobilizacao

Imobilizao de Enzimas
JANAINA DUARTE BAUMER SIANNAH MARIA MAS DIEGO Prof. Agenor Furigo Jr. Setembro/2008
O principal interesse em imobilizar uma enzima obter um biocatalisador com atividade e estabilidade que no sejam afetadas durante o processo.
Os processos de bioconverso enzimtica tm sido bastante utilizados na produo, transformao e valorizao de matrias-primas.
Reaes Enzimticas
Reatores Batelada
Desvantagens
Custos operacionais Baixa Produtividade Problemas de Remoo da E Variao na Qualidade dos Produtos
Visando a obteno de reaes com: > uniformidade tecnolgica viabilidade econmica,
Utilizao de Enzimas na Forma Imobilizadas
Enzimas Livres x Imobilizadas

Livres Instabilidade Rpida perda da atividade cataltica No regenerao Imobilizadas Reutilizao Maior estabilidade (Faixas mais amplas de pH e Temp.) Menor interferncia de inibidores e/ou ativadores
Mtodos de Imobilizao
Existem duas principais tcnicas: Modificao qumica da molcula: + Substrato no sofre impedimento estrico pela matriz - Pode ocorrer ligao atravs do stio ativo tornando-se inativa Ligao fsica da enzima em uma matriz inerte: + Maior velocidade de reao e facilidade no preparo - Impedimento estrico da molcula de substrato
Mtodos para Imobilizao de Enzimas
Ligao em Suportes Slidos
Confinamento
Matriz - Adsoro (carvo ativo) - Ligao Covalente (celulose, slica) - Ligao Inica (celulose)
Cpsula
Microcpsula
1. Imobilizao por incluso (Confinamento): Retidas na rede tridimensional de um polmero insolvel na gua; Aprisionadas no interior de cpsulas ou microcpsulas delimitadas por uma membrana semipermevel; No estabelecida ligao qumica ao suporte e conserva a sua integridade molecular. 1.1 Incluso em uma matriz; 1.2 Encapsulao; 1.3 Microencapsulao.
1.1 Incluso em uma matriz;
Em linhas gerais consiste no aprisionamento das molculas de enzimas entre as malhas de um polmero geliforme.
1. 1.1 Incluso em uma matriz; Simples ligao fsica entre enzima e suporte; Nesse caso no h risco de desnaturao, pois no so empregados reagentes qumicos, As limitaes difusionais so intensas.
1. 1.1 Incluso em uma matriz; Matriz Polmeros sintticos Silicone, Poliuretano, Nylon, Polissacardeos Alginato, Quitosana, Pectina, Protenas Colgeno, Gelatina Albumina,
1.2 Encapsulamento: A enzima imobilizada no interior de esferas, cujo envoltrio constitudo por um polmero geliforme e semipermevel.
E E E
E E
1.2 Encapsulamento:
Enzima em uma soluo aq.de Na

E
Gotejada
Soluo aq. contendo on bivalentes (Ca2+) Quando a gota de alginato de Na entra em contato com a sol. salina
Forma-se uma esfera, dentro da qual as E ficam retidas (membrana = polmero de alginato de Ca)
1.3 Microencapsulamento Consiste na preparao de um sist. emulsionado, onde a enz. est confinada no interior das micelas. No se pode encapsular enz. que destruam a matriz polimrica. Enz. hidrolticas no so adequadas para o encapsulamento, pois seu substrato de interesse geralmente de alto peso molecular. Polimerizao provoca desativao da enzima
1.3 Microencapsulamento
Soluo aq. de enzima
Hexametilenodiamina Fase orgnica
Cl. de sebacila Emulsificante
Resultante da polimerizao da diamina com cl. de sebacila
Obtm-se as gotculas da soluo enzimtica envolvidas por uma pelcula semi-permevel
1.3 Microencapsulamento
Vantagens e incovenientes dos mtodos de incluso: Convm a quase todos os tipos de enzimas; Restrio pelos fenmenos de impedimento estrico e de difuso atravs do gel ou da membrana.
2. Fixao das enzimas sobre suporte slido: A enzima deve ser fixar to solidamente quanto possvel; Bentonita: Insolvel em gua, mas uma vez hidratada intumesce e abre-se como uma espoja altamente porosa e carregada magnticamente. 2.1 Fixao por adsoro 2.2 Fixao das enzimas por ligaes covalentes
2.1. Adsoro Consiste da unio entre a enz. e um suporte inerte atravs de interaes inicas, adsoro fsica, ligaes hidrofbicas e foras atrativas de Van der Waals. Suportes:
Orgnicos Inorgnicos
Derivados da DEAEcelulose, Dowex Celite, bentonita e alumina
2.1 Fixao por adsoro Trata-se de um mtodo simples, de aplicabilidade generalizada. Efetua-se por simples mistura da enz. com o suporte, mas condies de pH e fora inica adequados, em seguida lava-se a enz. que no ficou ligada. Suportes: Carvo ativado, xidos metlicos, vidros, resinas polimricas.
2.1 Fixao por adsoro Diferentes parmetros vo influenciar na quantidade de enz. fixada e solidaridade das ligaes: Do pH do meio dependem o nmero e a natureza das cargas sustentadas pelo suporte. Sais em [ ] aumentam a solubilidade das enz. Com da T existe a probabilidade de se aumentar a criao de ligaes
2.1 Fixao por adsoro Vantagens: Procedimento extremamente simples custos Ligao ocorre por simples exposio e as condies so brandas Os efeitos difusionais so despresveis Desvantagens: Enz. so altamente dependentes de pH, solventes, substrato e Temp. Podem ser facilmente dessorvidas com a alterao destes parmetros * uma das tcnicas mais usadas.
2.2 Fixao por formao de ligaes covalentes A enz. ligada ao suporte inerte mediante ligaes qumicas covalentes, que so, normalmente, estabelecidas entre os aminogrupos primrios e o anel fenlico dos aa constituintes da enz. com os grupos reativos do suporte (-CHO;-NCS, dentre outros).
2.2 Fixao por formao de ligaes covalentes Em geral, as reaes so feitas em meio aquoso, Temp. entre 0C e 25C e o pH prximo neutralidade A escolha das condies ir depender da estabilidade da enz. e do suporte frente ao pH de formao das ligaes covalentes, assim como a estabilidade das ligaes suporte-enzima frente ao pH de utilizao do sistema imobilizado.
2.2 Fixao das enzimas por ligaes covalentes Vantagens: Maior eficincia e estabilidade. No so to suscetveis a pH, fora inica, solventes e Temp. Os suportes so escolhidos por suas propriedades de solubilidade, grupos funcionais, estabilidade mecnica, rea superficial, intumescimento e natureza hidroflica ou hidrofbica. Suportes: inorgnicos, polmeros naturais e sintticos.
2.2 Fixao das enzimas por ligaes covalentes Suportes: Vidro; Slica; Sephadex; Celulose; Nylon; Poliestireno.
Efeitos causados pela imobilizao Ao se agregar uma E a um material inerte, por mais suave que seja o procedimento, razovel esperar algum tipo de efeito sobre sua atividade cataltica.
Efeitos causados pela imobilizao
Interferncia da imobilizao sobre a atividade cataltica da E.
Tabela 3. Caractersticas cinticas e parmetros termodinmicos para a invertase nas formas solvel e insolvel
Dentre os vrios efeitos que a imobilizao pode causar salienta-se: Modificao da estrutura tridimensional Efeitos estricos e de conformao Efeitos de Microambiente Efeitos difusionais Resistncia difusionais externas Efeitos difusionais internos

Efeitos estricos e de conformao

Quando a enz. ligada ao suporte, pode sofrer alguma mudana na conformao, o que poder abalar sua eficincia cataltica. O processo de interao enz. suporte quase sempre aleatrio, poder suceder que a regio do sitio ativo se torne menos acessvel ao substrato (impedimento estrico).

Efeitos de microambiente Quando a E ligada a um suporte inerte, ela vai ficar sujeita a uma circunvizinhana algo do que quando esta livre. Esse fato poder se refletir sobre os valores dos parmetros cinticos. Os efeitos da circunvizinhana, que dependem da natureza fsica e qumica do suporte, podem acarretar uma distribuio desigual do substrato, produto e cofatores entre a regio vizinha do sist. imobilizado e o resto da soluo.

Efeitos de microambiente
O comportamento cintico de uma enzima presa a um suporte carregado pode diferir daquela apresentado pela enzima livre.

Efeitos Difusionais
Quando a E imobilizada sobre ou dentro de um suporte slido, o substrato deve se difundir do seio da soluo at o sitio ativo da E. Se a velocidade de difuso do substrato < que a veloc. de transformao pela E = a veloc. observada mais baixa do que a esperada, visto que nem todas as molculas de E estaro em contato com o substrato, (atingem a saturao).

Efeitos Difusionais
Resistncia difusionais externas Surgem devido ao fato de que o substrato deve ser transportado do seio da soluo at a superfcie de catlise Efeitos difusionais internos Surgem devido movimentao do substrato no interior do meio cataltico poroso
Propriedades de Enzimas Imobilizadas

Medida da atividade: Atividade residual de E imobilizada mais fraca que a das E nativa, mas a estabilidade maior Influencia das condies operacionais: pH e T p desnaturao parcial ou total da protena; Imobilizada p resistem melhor a variaes de pH e tratamentos trmicos;
Vantagens As enzimas podem ser reutilizadas Os processos qumicos podem ser continuamente operados e prontamente controlados Os produtos podem ser facilmente separados Os problemas de efluentes so minimizados A repetibilidade do processo pode ser aumentada estabilidade custos
Desvantagens Aleatoridade da interao enzima-substrato; Inexistncia de um mtodo geral imobilizacao; Atividade cataltica devido a efeitos:
de
Difusionais Estricos / Conformacionais
Microambiente
Tipos de Suporte Existem inmeros materiais inertes que podem ser usados. A natureza fsica desses suportes pode variar, desde materiais geliformes at superfcies slidas (prolas de vidros) recobertas com alguma substncia capaz de interagir com a E. A escolha do mtodo de imobilizao e do tipo de suporte depender, essencialmente, de dois fatores: - das caractersticas peculiares da E - das condies de uso da E imobilizada
Tipos de Suporte No existe um mtodo geral de imobilizao e nem um suporte universal. Geralmente as condies de imobilizao para uma E s poderam ser estabelecidas empiricamente.
Enzima
Imobilizar
Vrios Suportes e Diferentes Mtodos Avaliar a Atividade do Sistema
Escolher o suporte e o mtodo que apresentam > atividade
Tipos de Suporte Tabela 1. Classificao de suportes inertes.
Tipos de Suporte Tabela 2. Atividade da esterase de Bacillus subtilis imobilizada em vrios suportes e por diferentes mtodos.
Tipos de Suporte
Exemplo 1: AVALIAO DA ATIVIDADE DE LIPASES IMOBILIZADAS EM GEL DE PECTINA (Santos et al.,1997).
Foi realizado um estudo sobre a atividade de diferentes lipases (lipases de Candida rugosa, Pseudomonas cepacia, Mucor javanicus e Lipolase) imobilizadas em gel de pectina, avaliando sua atividade cataltica em meio orgnico.
A pectina heteropolissacarideo que formar gis em presena de ctions Preparo do gel de pectina:
9 mL de uma soluo tampo fosfato, pH 7,2 Sol. Aq. de E esfriada a 40C
0,8 g de pectina ctrica aquecida at a completa dissoluo
agitada vigorosa e deixada esfriar a T ambiente.
Gel de pectina Sol. Cl. Clcio formar um sist. rgido e estvel
Removidos para um erlenmeyer contendo 25 mL de hexano.
Cortados em peq. cubos de 125 mm3
Foi avaliado a atividade das E imobilizadas neste gel atravs da reao de esterifcao do c. lurico com o n-pentanol. Foram utilizados quantidades equimolares dos substratos (0,01 mol). As reaes foram realizadas em uma incubadora sob agitao a 25C.
Tabela 1 Rendimentos para a reao de esterificao do c. lurico com o n-pentanol catalisada por diferentes lipases imobilizadas em gel de pectina.
Tabela 1Rendimentos para a reao de esterificao do cido lurico com o n-pentanol catalisada por diferentes lipases imobilizadas em gel de pectina.
Lipases de Candida rugosa com diferentes AE e procedncias (Amano e Sigma), foram imobilizadas no gel de pectina, nas mesmas condies descritas anteriormente variando-se a [ ] de enzima.
Quanto > a [Enz.] > o rendimento
Estes resultados demonstram: Que quando E so imobilizadas por mtodos de envolvimento, a quantidade de biocatalisador e AE so fatores importante para uma catlise + eficiente, uma vez que as reaes ocorrem por difuso dos substratos no gel. Viabilidade do uso do gel de pectina como suporte para a imobilizao de enzimas e sua aplicao em meio orgnico.
Exemplo 2: Determinao das propriedades catalticas em meio aquoso e orgnico da lipase de Candida rugosa imobilizada em celulignina quimicamente modificada por carbonildiimidazol
(Fabrcio M. Gomes; Ariela V. de Paula; Grazielle dos S. Silva; Heizir F. de Castro; 2006)
Imobilizao da lipase em celulignina O suporte foi inicialmente neutralizado pela adio de uma sol. de hidrxido de sdio (0,1 M) e, em seguida, tratado com carbonildiimidazol diludo em dimetilsulfxido (5 mg/mL). A imobilizao consistiu do contato da sol. enzimtica (250 U) com o suporte previamente umedecido com hexano na presena de polietilenoglicol por 21 h. A enzima imobilizada foi recuperada por filtrao a vcuo e o sistema lavado com hexano gelado para reduo do teor de gua.
Propriedades catalticas da imobilizada em meio aquoso
lipase
livre
A atividade enzimtica da lipase nas formas livre e imobilizada foi determinada pelo mtodo de hidrlise do azeite de oliva.
Para verificar as alteraes causadas nas propriedades originais da lipase livre, foi determinada a influncia do pH e da T na AE das lipases livre e imobilizada, bem como estimados os parmetros cinticos.
Influncia do pH
imobilizao deslocou o pH timo da enz. livre, para um valor de pH + bsico.
Influncia do pH
Mudanas conformacionais da enz. ou alteraes de [ ] entre as espcies carregadas, substrato, produto, ons H, ons OH, tanto no microambiente da enz. imobilizada quanto no meio reacional (macroambiente).
Influncia da Temperatura
A imobilizao parece conferir alguma proteo enzima
Influncia da Temperatura
Imobilizao: Ttima, o que permite operaes em uma faixa > de T. O da Ttima deve-se ligao da E ao suporte, impedindo o desdobramento da estrutura terciria.
Parmetros cinticos Nas Figuras 3 e 4 so apresentadas as atividades da lipase livre e imobilizada, respectivamente, em funo da [ ] de cidos graxos presentes na emulso leo e gua contendo diferentes propores de azeite de oliva (10-50% m/v).
Parmetros cinticos
Parmetros cinticos
Cintica do tipo Michaelis-Menten
Sem inibio por P ou reduo do teor de gua no meio reacional
As constantes de afinidade pelo substrato (Km) e a Vmax de reao foram calculadas com auxlio do programa Enzyme Fitter.
As constantes de afinidade pelo substrato (Km) e a Vmax de reao foram calculadas com auxlio do programa Enzyme Fitter.
Mediante imobilizao, a afinidade da lipase pelo substrato foi . Esse comportamento se deve < transferncia de massa do meio reacional para o sist. imobilizado, pois o processo de imobilizao reduz a difuso do substrato nos interstcios do suporte
Este um perfil tpico dos sistemas imobilizados, tendo em vista que a E livre exerce sua atividade cataltica em um meio homogneo, enquanto a E imobilizada em um suporte slido deve agir em um meio heterogneo. O da atividade das enzimas imobilizadas s mudanas conformacionais na sua estrutura terciria impedimentos estricos.
Testes de estabilidade Estabilidade estocagem A lipase imobilizada foi estocada a uma temperatura de 4 C por 90 dias.
Testes de estabilidade Estabilidade estocagem A lipase imobilizada foi estocada a uma temperatura de 4 C por 90 dias.
Estvel por 30 dias
Estabilidade trmica
Estabilidade trmica
97% 60%
Estabilidade trmica
37% 9%
Exemplo 3: Imobilizao de Lipase de Candida antarctica B em Esferas de Quitosana para Obteno de BiodieseI por Transesterificao de leo de Mamona (Cruz Jr., Amrico; Pacheco, Sabrina Moro Villela; Furigo Jr, Agenor; 2008)
Produo de biodiesel
transesterificao (reao qumica dos c. graxos contidos nos leos vegetais ou gorduras animais com o etanol ou o metanol estimulado por um catalisador - cidos, bsicos ou enzimticos).
Indstrias qumicas utilizam a catlise bsica. Esse processo possui vrios inconvenientes como a baixa seletividade do catalisador, levando a indesejveis reaes paralelas. Considerados como not ecologically friendly Suas desvantagens impulsionaram a pesquisa por novos catalisadores lipases.
As lipases ( EC 3.1.1.3) catalisam a hidrlise e a sntese de steres formados a partir do glicerol e c. graxos de cadeias longas.
As lipases ( EC 3.1.1.3) catalisam a hidrlise e a sntese de steres formados a partir do glicerol e c. graxos de cadeias longas.
Lipase Livre
Invivel
Biopolmero imobilizadas em suportes Quitosana slidos, que lhes conferem > resistncia e facilitam sua recuperao
perdem atividade em condies e meios desnaturantes
a vida til
Otimizao do processo de ativao: O processo de ativao das esferas de quitosana consistiu em adicionar 2mL de solues de glutaraldedo 0, 1, 3, 5, 7 e 9% (v/v) em 30 esferas de quitosana (perodo de incubao de 24 h 25oC). Atravs dos resultados obtidos, foi possvel observar que ocorreu uma significativa queda na AE do sobrenadante, quando a sol. enzimtica foi incubada com esferas ativadas com soluo de glutaraldedo 3%.
Quando a molcula da E est ligada a um suporte, ela precisa conservar suas distncias intermoleculares o que torna sua conformao + rgida = + resistente a mudanas conformacionais induzidas por ag. desnaturantes. No entanto, quando a [ ] de glutaraldedo usada muito alta, uma quantia > de grupos aldedos reage com um nmero > de resduos da E tornando sua estrutura muito rgida, com conseqente distoro de sua conformao = a perda de atividade. Necessidade da otimizao do processo imobilizao da E nas esferas de quitosana
de
Caracterizao das E imobilizada comercialmente: Anlise de AE em pHs (3,0 - 10,0 a 25oC) e temp. (25 - 100oC em pH 9,0). Os estudos relacionados ao perfil de atividade x pH e atividade x temp., revelaram que: CALB L pH 5,0 e 100C, NOVOZYM 435 pH 9,0 e 100C
A reao de transesterificao para a produo do biodiesel foi realizada atravs da incubao do leo de mamona e etanol na razo 3:1 juntamente com 3% m/m de E em um reator tipo batelada, de 0,5 L. Na reao de transesterificao com o leo de mamona e o etanol, foi possvel observar uma eficiente taxa de converso de triglicerdeos para seus respectivos steres etlicos.

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Soluo aq. de enzima

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Cl. de sebacila Emulsificante

Resultante da polimerizao da diamina com cl. de sebacila

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Efeitos estricos e de conformao

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Vrios Suportes e Diferentes Mtodos Avaliar a Atividade do Sistema

Escolher o suporte e o mtodo que apresentam > atividade

9 mL de uma soluo tampo fosfato, pH 7,2 Sol. Aq. de E esfriada a 40C

0,8 g de pectina ctrica aquecida at a completa dissoluo

agitada vigorosa e deixada esfriar a T ambiente.

Removidos para um erlenmeyer contendo 25 mL de hexano.

Cortados em peq. cubos de 125 mm3

Quanto > a [Enz.] > o rendimento

imobilizao deslocou o pH timo da enz. livre, para um valor de pH + bsico.

A imobilizao parece conferir alguma proteo enzima

Cintica do tipo Michaelis-Menten

Sem inibio por P ou reduo do teor de gua no meio reacional

Estvel por 30 dias

perdem atividade em condies e meios desnaturantes

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