Con l' evoluzione della tecnologia, si è evoluta anche la nostra conoscenza sui biofilm

Già nel 1600 Heukelekian e Marshall (1976)

Anton van Heller (1940) Characklis (1973) scopre che i batteri
Leeuwenhoek osservarono una scopre che le si ancorano alla
osservò gli crescita maggiore colonie batteriche superficie grazie a
“animaliculae” di microrganismi sono resistenti fibrille
sulla superficie su superfici di agli antimicrobici extracellulari
dei denti adesione polimeriche
Lappin_Scott
dimostrarono
che l’adesione Costerton osserva
induce che il biofilm è
CLSM
l'espressione di una microcolonia
geni coinvolti di cellule,
Microscopio incastonate in una
nella
elettronico a formazione del matrice idratata
biofilm
scansione

Propone una teoria per

la quale i biofilm
possono colonizzare
superfici biotiche e
abiotiche, e per la
quale la maggior parte
dei batteri si sviluppa
in una vita sessile
E' un'aggregazione complessa di microrganismi, contraddistinta da:
●
Adesione ad una superficie; Vita planctonica
●
Eterogeneità strutturale;
●
Interazioni biologiche;
●
Una matrice adesiva e protettiva di carattere polisaccaridico.
Vita sessile
 Perchè passare da una vita Kolter afferma che ciò
planctonica a una sessile? avviene quando i
Per assicurarsi microrganismi si
la trovano in condizioni
sopravvivenza e difficili di vita. In
la riproduzione laboratorio vengono
coltivati in provette
Maggiore Assenza di dove vengono inseriti
resistenza agli sostanze tutti i nutrienti
antibiotici nutritive necessari ai singoli
batteri che quindi
riescono a sopravvivere
in solitudine.
Ciò comporta l' attivazione o la disattivazione di alcuni geni del
DNA
Co-aggregazione: fenomeno mediante il quale i batteri appartenenti a specie e/o generi diversi
si associano formando biofilm, grazie alle adesine e a recettori specifici.
●
Il colonizzatore primario aderisce al substrato grazie ad interazioni di Van der Waals,
formando un film di condizionamento. Se le condizioni sono ottimali ci sarà la formazione delle
prime microcolonie;
●
I primi colonizzatori sono coperti da una seconda colonizzazione batterica, formando un
biofilm multispecie.
 Costituita da
Il biofilm è tenuto sostanze polimeriche
insieme e protetto da extracellulari (EPS)
una matrice di
composti polimerici Serve al
escreti mantenimento
dell'omeostasi

Varia a seconda dello stato

fisiologico delle cellule, della
quantità di nutrienti, delle specie
Costituisce il Cresce con che la compongono
50-90% del l' età dei
biofilm biofilm
Composizione della matrice del biofilm
SOSTANZE %
Acqua  97 %
Contribuisce alla resistenza agli Cellule batteriche 2-5 % (più specie)
antibiotici, impedendone il Polisaccaridi 1-2 % (neutri o polianionici)
trasporto attraverso il biofilm Proteine (prodotte da lisi
 1-2 % (compresi gli enzimi)
cellulare)
 1-2 % (prodotti da lisi
DNA e RNA
cellulare)
Ioni Legati o liberi
Composizione della matrice
• La MOTILITA’ è importante per superare le forze di repulsione nei
confronti dei batteri di parecchi materiali abiotici

• Nelle prime fasi della formazione del biofilm un ruolo importante è

svolto dagli organelli responsabili della motilità cellulare, come pili e
flagelli

• PILI DI TIPO I : adesine sensibili al mannosio; coinvolte nel

processo di ADESIONE
- quando i batteri hanno raggiunto una superficie, i pilidi tipo I sono
responsabili dell’ATTACCAMENTO CELLULA-SUPERFICIE 
diffusione del biofilm
Flagelli
• E’ stato dimostrato che i mutanti mancanti di FLAGELLI o con
flagelli paralizzati non riescono o hanno considerevoli difficoltà nel
formare un biofilm

• I PILI DI TIPO IV hanno un ruolo nella produzione di pellicole e

nella formazione di microcolonie ( = accumulo di cellule)

• TWITCHING (MOBILITA’ CONTRAENTE): ritrazione ed

estensione dei pili di tipo IV che provocano la migrazione delle
cellule

• Mutanti difettivi dei pili di tipo IV sono in grado di formare piccoli

monostrati che però non riescono ad aderire fra loro e si disperdono
singolarmente senza mai arrivare a formare una microcolonia
• In natura i microrganismi sono attirati da superfici solide su cui si depositano, aderiscono e si
moltiplicano attivamente formando COLONIE costituite da: batteri, matrice extracellulare,
nutrienti, detriti organici e inorganici e altri microrganismi  BIOFILM

• I biofilm si formano anche in presenza di elevati flussi nei sistemi naturali e industriali

FASI DELLA FORMAZIONE DI UN BIOFILM

oAdesione alla superficie

oFormazione di microcolonie
oMaturazione dei biofilm

• Fattori che determinano la formazione di un biofilm: - pH, osmolarità, disponibilità di Fe, O,

nutrienti
(primi passaggi)
- quorum sensing (maturazione)
su piccole superfici: bassa resistenza alla trazione
Biofilm :
su superfici più estese: forti e resistenti alla rottura meccanica

• La struttura risultante è altamente viscoelastica con caratteristiche di materiale gommoso

• Dipende dal contatto diretto con la superficie e
dalle interazioni cellula-superficie che si
instaurano

• La regolazione non è genetica, ma ci sono diversi

meccanismi

• INTERAZIONI CELLULA-SUPERFICI  • Produzione di EPS  biofilm maturo

contatto, condizioni ambientali
• Strato omogeneo di cellule o struttura complessa
con canali dell’acqua

composizione
batterica
• Variabilità del biofilm maturo
condizioni
ambientali

disponibilità di nutrienti
• MICROCOLONIE: comunità batteriche di 3-5 • Regolazione
strati sviluppate in seguito all’adesione Quorum sensing

SVILUPPO CLONALE
• Meccanismi determinanti
INTERAZIONI STABILI CELLULA-CELLULA

• Sintesi del polisaccaride extracellulare

• I biofilm hanno un ruolo sia nelle malattie quali fibrosi cistica e periodontiti sia
nelle infezioni dell’apparato urinario e della circolazione sanguigna

• Le patologie sono più frequenti in soggetti immunodepressi

Meccanismi della PATOGENESI:

•Distacco di aggregati batterici dai biofilm con
diffusione in altri distretti

•Produzione di esotossine

•Resistenza al sistema immunitario attraverso

plasmidi di resistenza derivanti da processi di
coniugazione
 • Gli aggregati multi-cellulari hanno una
maggiore resistenza agli agenti
antimicrobici  la popolazione sessile
difficilmente può essere rimossa
dall’organismo-ospite se non in maniera
chirurgica

• I biofilm permettono la sopravvivenza delle

cellule batteriche in un ambiente ostile

• Le popolazioni batteriche planctoniche sono

però più esposte a svariati fattori deleteri
per la loro sopravvivenza.

• I biofilm batterici sono coinvolti in un

numero impressionante di infezioni
batteriche croniche
 • La patogenicità dei biofilm è strettamente correlata alle sue
CARATTERISTICHE STRUTTURALI
Biofilm e infezioni nell’uomo

• I biofilm possono colonizzare e dunque Infezioni o malattia Biofilm (specie batterica principale)
Cocchi Gram-positivi acidofili
infettare sia i tessuti dell’ospite sia Carie dentali
(es. streptococchi)
alcuni dispositivi medici impiantabili; Otite media Ceppi di Haemophilus influenzae
per questo motivo sono oggetto di Infezioni Cocchi Gram-positivi
muscoloscheletriche (es. stafilococchi)
continua ricerca in campo medico Infezioni del tratto
Batteri enterici (es. Escherichia coli)
gastro-intestinale
• Comuni caratteristiche cliniche delle Endocardite Streptococchi gruppo viridans
Polmonite associata a fibrosi
infezioni da biofilm: cistica
P. aeruginosa
- si sviluppano su superfici inerti o
tessuto morto
- crescono lentamente  i sintomi delle
infezioni si manifestano con un certo
ritardo
- rilascio di batteri in forma planctonica
(infezione acuta)
• Possono essere trattate con una
terapia antibiotica arrivando alla
completa guarigione
• Quando le difese immunitarie
dell’organismo ospite non riescono a
combattere l’infezione da biofilm, da
quest’ultimo vengono continuamente
rilasciati dei batteri planctonici che si
disperdono negli altri tessuti
provocando delle infezioni acute
INFEZIONI DA OPPORTUNISTI: tipiche dei patogeni opportunisti, si manifestano solo nei soggetti immunodepressi
• Meccanismo poco conosciuto
• Non si rimuove la causa, ma l’organismo la
circoscrive
• Risposta granulomatosa
• Le infezioni croniche sono direttamente
causate dall’adesione dei batteri alla
superficie interessata; sono quindi tipiche
della forma di vita sessile
• Tessuti prelevati da infezioni croniche non
associate all’uso di dispositivi medici
contaminati mostrano anche la presenza di
biofilm batterici circondati da EPS
• Gli aggregati multi-cellulari o biofilm permettono alle singole cellule batteriche che li
compongono di esibire un comportamento coordinato conferendo loro vantaggi biologici
come la resistenza agli antibiotici

• Il confronto fra la concentrazione minima inibente (MIC) e la minima concentrazione di

eradicazione di biofilm (MBEC) mostrano le differenze esistenti fra cellule planctoniche e
cellule sessili

• Le resistenza antimicrobica dei biofilm NON è genotipica, ma è dovuta a strategie

multicellulari e alla capacità di singole cellule, interne al biofilm, di differenziarsi in uno
strato fenotipico tollerante all’azione antibiotica (cellule persistenti)

• RESISTENZA MULTIFATTORIALE

• Meccanismi responsabili della resistenza:

- penetrazione ritardata dell’agente antimicrobico attraverso la matrice del biofilm 

cellule superficiali
- accrescimento cellulare rallentato dovuto a riduzione di nutrienti e cambiamenti chimico-
fisici  cellule intermedie
- elaborazione di un fenotipo specifico resistente agli antibiotici  cellule profonde
• L’attacco di un biofilm ad un tessuto
risulta più potente quanto più è alta la
densità del batterio presente
(concetto di QUORUM SENSING).

• Alcuni batteri non sono capaci di

sferrare un attacco forte ed
efficace formando soltanto biofilm
monospecie, ma necessitano di altri
batteri come supporto (es. B. Cepacia
con P.Aeruginosa)  si formano
COLONIE MISTE più difficili da
eradicare.

• L’azione patogena dei biofilm può

essere fortemente limitata in caso di
MUTAZIONI che coinvolgono
principalmente le molecole segnale e i
mezzi di comunicazione fra i batteri.

Ricerche sui batteri condotti negli ultimi 15
anni hanno rivelato che i batteri non sono
soltanto delle forme di vita solitarie, ma
esse possono COMUNICARE fra loro
attraverso un LINGUAGGIO CHIMICO.
La comunicazione può avvenire fra batteri
della stessa specie o di specie diverse,
spesso però è necessaria l’appartenenza allo
stesso ceppo.
La comunicazione è finalizzata
all’elaborazione di strategie di gruppo in
risposta a situazioni avverse (ambiente
ostili, concorrenza di altri microrganismi
ecc…) o all’attacco dell’organismo ospite.
Quando la concentrazione di molecole
segnale supera una data soglia si attiva un
INTERRUTTORE che induce o silenzia
l’espressione di determinati geni
QUORUM SENSING
• Scambio di materiale genetico
(PLASMIDI)
• Mobilità cellulare
• Formazione di BIOFILM
• Produzione di FATTORI DI
VIRULENZA

Questa avviene attraverso MOLECOLE

SEGNALE prodotte all’interno della cellula e
successivamente liberate, la cui aumentata
concentrazione indica un’alta densità si
batteri presenti nell’ambiente.
 Attivazione delle proteine luminescenti mediante il rapporto
simbiontico del batterio Vibrio fischeri con un particolare tipo
di cefalopode.
STRUTTURE DI QUATTRO INDUTTORI DEL QUORUM SENSING
A= N-BUTANOIL-L- OMOSERINA-LATTONE
B= N-ESANOIL-L-OMOSERINA-LATTONE
C= CICLO (L-TYR-L-PRO)
D= (L-LEU-L-PRO)
GRAM NEGATIVI
QUORUM SENSING
GRAM POSITIVI
 • Batterio che colonizza le foglie
del tabacco e secerne enzimi per
la macerazione

• Studio del rapporto fra quorum

sensing e macerazione: varietà
transgeniche di tabacco che
degradano le molecole segnale
• Erwinia carotovora produce batteriche  Il batterio non è virulento nei
piccole quantità di antibiotico
contro i microrganismi
confronti della pianta
concorrenti
• I ceppi mutati incapaci di
produrre antibiotico ne
divengono capaci a contatto con
un secondo ceppo capace nello
stesso mezzo di coltura:
RILASCIO DELLE MOLECOLE SEGNALE
 Fattori di virulenza
•Aderenza
• Pseudomonas = falsa unità •Exotossina A
• Classe dei proteobatteri gamma •Proteasi
•Fosfolipasi
• Gram negativo •Sistema di secrezione di tipo III
• Forma a bastoncello (la colonia è di forma variabile) •Uptake del ferro
• Colore verde-blu per via della piocianina •Biofilm

• Aerobio obbligato
• E’ favorita la vita sessile

• Si adatta a vari ambienti  può usare diverse vie

metaboliche  numerosi meccanismi patogenici
• Patogeno opportunista Malattia genetica con trasmissione autosomica
recessiva
• Forma biofilm multispecie: attaccamento del batterio
all’epitelio polmonare Colpisce l’intero organismo
Swimming
• Meccanismi di movimento Il gene responsabile è situato sul braccio lungo
Twitching
del cromosoma 7 e codifica per la proteina
Swarning CFTR (proteina regolatrice transmembrana per
la fibrosi cistica) : regolazione dei canali di
• Capacità di generare diverse varianti con caratteristiche sodio e cloro e delle infiammazioni
fenotipiche differenti
• Infezioni acute: infezioni nosocomiali, polmoniti associate Nei polmoni vi è una secrezione eccessiva dalle
a respiratori meccanici o in pazienti immunodepressi ghiandole tracheobronchiali
• Patogenesi multifattoriale S. aureus  P. aeruginosa ( + B. cepacia )
 • A causa della fibrosi cistica nei polmoni si perde la via trasmembranaria che regola il cloro 
facile colonizzazione da parte del batterio P. aeruginosa

• All’inizio il fenotipo è non mucide  col fenotipo mucide abbiamo il biofilm

Fattori di conversione: stress, disidratazione, assenza di nutrienti

• Assenza del canale del cloro  alta concentrazione salina  inibizione dell’attività dei peptidi
antimicrobici

• Antigeni  Anticorpi non funzionanti  Ulteriore danneggiamento al tessuto polmonare

- strato di alginato
- ceppi mucoidi più resistenti
• Soppressione immunitaria
- età del biofilm

 Agenti eziologici ubiquitari e patogenici per individui

immunocompromessi e debilitati

 Lento sviluppo (con attacchi acuti curabili con terapia antibiotica)

 Non curabile con antibiotici convenzionali

 Anticorpi non efficaci nei confronti dei batteri sessili

 Microcolonie come focolai per la diffusione dell’infezione

• Un gruppo di ricercatori dell’Università della California ha condotto una serie di esperimenti su
E.coli

• BIOLOGIA SINTETICA: settore di studio che si propone di programmare la fisiologia e il

comportamento di cellule e organismi introducendo nuovi geni nel loro DNA e alterando i loro
processi metabolici

• Nuovo messaggero: ACETATO

• Attraverso l’introduzione di DNA contenente geni controllori, questi si attivano a contatto con
l’acetato  produzione di PROTEINE LUMINESCENTI

• Il batterio così manipolato emette luce quando percepisce la presenza di altri batteri della stessa
specie

• La soglia di risposta del sistema varia a seconda del grado di acidità dell’ambiente

• Potrebbe essere una nuova strategia per combattere alcuni batteri patogeni
• Timothy Lu, 29. Ricercatore al MIT
• Ha modificato il fago per l’eliminazione dei
biofilm e il sabotaggio delle loro difese contro
gli antibiotici
• Enzima prodotto dai batteri orali in grado di
superare le difese dei biofilm
• Il fago T7 contenete l’enzima appena arriva in
prossimità del biofilm attacca lo strato
superiore che esplode e sparge enzimi e fagi. Per
ogni strato del biofilm l’operazione è ripetuta
Altre tecniche in via di sviluppo:
Creazione di versioni in grado di sopprimere
l’attività di difesa dagli antibiotici
Iniezione di fagi nelle condutture dell’acqua (dal
punto di vista industriale).
• Gruppo di ricerca dell’università di
Boston
• VIRUS come mezzo per combattere
le infezioni e il problema della
resistenza agli antibiotici
• Porzioni di Dna esogeno all’interno si
un batteriofago (=virus che infetta
cellule batteriche)  il virus così
modificato è in grado di distruggere
i biofilm utilizzando il loro
macchinario biochimico e metabolico
e producendo ENZIMI
DEGRADATIVI
• Evidenze stanno dimostrando sempre
di più che tali batteriofagi risultano
fondamentale quando si ha a che
fare con un biofilm.
 BIBLIOGRAFIA
 http://it.wikipedia.org/wiki/Biofilm

 www.unipa.it/~dctfpal/schillaci/BIOFILMBATTERICI.doc

 http://pescini.dottorato.disco.unimib.it/wiki/data/media/pseudomon
as/tesi_new.pdf

 www.sa.unina2.it/download/appunti/appunto.../BIOFILM%20.doc

 http://www.technologyreview.it/?p=article&a=1781

 http://www.biotecheambiente.com/web/news.php?extend.6

 «La vita sociale dei batteri» art. di Cristina Valsecchi pubblicato su

«Le scienze», febbraio 2005
Giunta Cardinale Valeria

Griffo Giuseppe

Mancuso Salvatore

Motisi Giuseppe

Ribecca Roberta