La replicazione ha inizio in corrispondenza di siti specifici:

Origini di Replicazione
Cairns, 1963
Cellule di E. coli sono
state fatte replicare
per una generazione e
mezza in presenza di
timidina marcata con
[3H].
L’ansa a mostra una
densità di grani doppia
rispetto alle anse b e c.
L’ansa a ha replicato 2
volte nel terreno
marcato e possiede
entrambi i filamenti
marcati mentre le anse
b e c hanno solo un
filamento marcato.

1° generazione

2° generazione
Abbiamo visto il funzionamento di tutto il utilizzando di nuovo una marcatura del filamento
macchinario coinvolto nella replicazione, e di DNA e utilizzando un precursore della sintesi
abbiamo accennato che tutto quel macchinario del DNA cioè dei deossinucleotidi che
funziona in corrispondenza di una forca di contenevano la Timidina marcata con il Trizio (è
replicazione dove essa è rappresentata da una un isotopo radioattivo dell'idrogeno); e utilizzando
regione di DNA divisa in due parti. In una regione questa molecola marcata, la timidina veniva
troviamo due filamenti che sono separati e quindi incorporata nella molecola di DNA in via di sintesi.
sono in via di replicazione e nell'altra troviamo i Era possibile  successivamente utilizzando una
due filamenti ancora appaiati che devono essere tecnica che viene chiamata “autoradiografia”
ancora replicati.  ottenere un'immagine e rilevare quindi
l'emissione di radioattività da parte degli atomi di
Come funziona la replicazione? idrogeno, cioè da parte della molecola di DNA in
La replicazione inizia sempre in siti specifici, che cui questi atomi di idrogeno erano stati
vengono definiti “origini di replicazione”. incorporati, e facendo crescere delle cellule di
Iniziamo quindi a vedere come funzionano queste Escherichia Coli in un terreno contenente  questa
“origini di replicazione”  negli organismi timidina marcata per una generazione e mezza,
procariotici, quindi sui cromosomi circolari per cioè (vuol dire che il cromosoma aveva avuto la
esempio quello di Escherichia Coli. possibilità di dividersi una volta e aveva iniziato
Nell'esperimento notiamo proprio che il una seconda divisione) dopo questo tempo le
cromosoma di Escherichia Coli viene duplicato a cellule sono state bloccate e trattate in modo tale
partire da una singola origine di replicazione e le da poter isolare il cromosoma e poter osservare
due forche replicative si estendevano per l'emissione della radioattività dovuta al
replicare l'intera molecola. cromosoma su un vetrino, quindi al microscopio.
Quindi l'esperimento viene effettuato
Quello che si osservò fu una struttura che è stata filamento originale.
ricostruita nel parte bassa della slide, e che è costituita da
due diverse regioni, definite diverse nella quantità di Quindi dopo la prima generazione quello che si ottiene è
radioattività, quindi nell'intensità di questa linea che un filamento nero appaiato con il filamento azzurro e la
corrispondeva appunto alla filamento marcato e quindi porzione in rosso è la quantità di marcatura iniziata nella
c'era una parte della molecola quella che viene indicato seconda generazione ma non portata a compimento.
in basso con la lettera A che aveva  un'intensità di A destra sono rappresentate delle  immagini che
radioattività doppia rispetto alle anse B e C, e ciò voleva riproducono questo cromosoma in una fase precoce e in
dire che quella regione del DNA si era duplicata già due una fase tardiva.
volte in presenza della marcatura radioattiva. Quello che si vede nell'immagine “precoce” è  che se
Mentre la le parti B e C avevano replicato solo una volte blocchiamo la replicazione in un determinato momento si
perché come abbiamo detto è una generazione e mezza  vede questa bolla di replicazione, che in una fase
quindi dopo la prima generazione tutto il DNA è stato successiva cioè quella “tardiva” vede questa bolla aprirsi.
marcato ma ovviamente su un solo filamento. Erano ipotizzabili due meccanismi cioè che la bolla una
Diciamo che questa fu un'ulteriore conferma del fatto volta formatasi si potesse aprire in modo bidirezionale
che il DNA veniva duplicato in  modo semiconservativo vedete le frecce nere che vanno da entrambi i lati oppure
perché proprio dopo una generazione, solo uno dei due unidirezionale con quello che viene chiamato D-loop.  
filamenti era marcato radioattivamente.
Nella parte C per distinguere un avanzamento della
All'inizio della seconda generazione si osserva una parte replicazione unidirezionale o bidirezionale abbiamo
del filamento che raddoppia, quindi è iniziato utilizzato esperimenti simile a quello già mostrato che
nuovamente un ciclo di replicazione e la parte di hanno permesso di capire quale dei due meccanismi
cromosoma che era già stata duplicata due volte appariva avvenisse, perché andando ad osservare la marcatura
doppia. E questo voleva dire che il meccanismo della radioattiva nel caso in cui l'avanzamento della forca fosse
duplicazione iniziava solo in un punto quindi non c’era unidirezionale si sarebbe dovuto osservare la presenza
più la possibilità di osservare forme diverse di questo della radioattività solo in una direzione, mentre nel caso
cromosoma. di un avanzamento bidirezionale la radioattività doveva
Quindi la duplicazione iniziava in un punto e poi si essere presente su entrambi i lati di questa origine di
propaga lungo tutta la molecola.  replicazione.
Nell'immagine notiamo che il filamento nero sia il
Il cromosoma circolare di E. coli ha 1 origine / 4x106 bp
definita oriC
La replicazione è bidirezionale

oriC
500-1000 nt/sec
Grazie a questi esperimenti si dimostrò che c'era un'unica origine di
replicazione rispetto all’intero cromosoma, che è costituito da 4 milioni
di coppie di basi e questa venne definita “oriC”. 
A volte viene riferita all'immagine della struttura che si viene a formare
la lettera “theta” , proprio perché questi cromosomi marcati col trizio
radioattivo in via di replicazione ricordano la forma di tale lettera.
è stato possibile verificare nel caso del cromosoma di Escherichia Coli, a
partire dall'origine, che si formano due forche di replicazione che
avanzano bidirezionalmente, e di queste forche è stata anche misurata
la velocità di avanzamento, e cioè la velocità di sintesi del DNA che
corrisponde a circa 500\1000 nucleotidi al secondo. 
Quindi si parla una velocità molto alta che permette agli  Escherichia
Coli di duplicare il suo DNA nel tempo di generazione che è tipico di
questo microrganismo.
Modello del Replicone (Jacob et al. 1963)
L’evento che da’ inizio alla duplicazione è il risultato
dell’interazione tra un replicatore e un iniziatore

Replicatore:
insieme di sequenze cis-agenti
sufficienti per dirigere l’inizio della
replicazione

Iniziatore:
Elemento trans-agente (proteina) in
grado di riconoscere il replicatore e
innescare l’inizio della replicazione
Sulla base dei dati ottenuti con gli esperimenti di microscopia, si cominciò ad
immaginare come queste origini di replicazione potessero funzionare e come
fossero in grado di dare il via alla sintesi dei nuovi filamenti di DNA.
Fu proposto il modello del Replicone da parte di un gruppo di scienziati tra cui
Jacob.
E l'evento secondo questo modello del Replicone che dà inizio alla replicazione
deve essere il risultato dell'interazione tra un replicatore è un iniziatore, laddove il
replicatore è un insieme di sequenze di DNA presenti in corrispondenza
dell'origine di replicazione. Le sequenze sono definite elementi “cis-agenti” e
sono sufficienti per dirigere l'inizio della replicazione. 
Sono definite “cis-agenti” perché agiscono in “cis” cioè sul sito stesso della
molecola che deve andare incontro al processo e l'iniziatore invece doveva essere
un elemento “trans-agente” quindi che veniva dall'esterno, e non faceva parte
della molecola di DNA e quindi molto probabilmente doveva trattarsi di una
proteina che fosse in grado di riconoscere il replicatore e in qualche modo
innescare l'inizio della replicazione. Quindi per semplificare nello schema, 
l'iniziatore è una proteina che va a legarsi e a riconoscere le sequenze presenti
all'interno dell'origine a partire da una regione che per motivi strutturali è più
facile da denaturare si da inizio alla separazione dei filamenti.
La separazione dei filamenti innesca poi il reclutamento delle proteine che
devono essere coinvolte nel processo.
Origini di Replicazione di diversi organismi

Siti di legame dell’iniziatore

Siti che facilitano l’apertura della doppia elica
Origini
Il modello del Replicone si dimostrò corretto.
Infatti analizzando diversi origini di replicazione a partire da diversi
organismi si osservò che questi contenevano particolari tipi di
sequenze. 
Nell’immagine notiamo tre diversi tipi di sequenze, quella di
Escherichia Coli, quella del virus eucariotico SV40 e l’ultima quella del
Saccharomyces Cerevisiae.
In tutti i casi si riscontrano dei siti che sono indicati col colore “verde” e
che corrispondono a delle sequenze che sono effettivamente
riconosciute da proteine iniziatrici, quindi proteine che sono in grado
di legarsi e che rappresentano il primo segnale per l'inizio della
replicazione.
Poi ci sono delle sequenze indicate in “azzurro” che per le loro
caratteristiche strutturali, sono proprio le sequenze in corrispondenza
delle quali avviene la prima denaturazione del DNA.
Poi in “rosso” sono invece indicate le vere e proprie origini che sono i
punti in cui effettivamente inizia la sintesi dei nuovi filamenti di DNA.
 Organizzazione di oriC

GATCTNTTNTTTT TTATCCACA

- 5 copie di una sequenza di 9 nucleotidi bersaglio dell’iniziatore DnaA (1-

5)
- 3 sequenze di 13 nucleotidi ricche in A-T (L, M, R)
- 14 copie della sequenza GATC bersaglio della DAM metilasi ( )
Andiamo a vedere nel dettaglio come è organizzato l’ “origine di
replicazione” in Escherichia Coli. 
La sequenza corrispondente agli “oriC” degli E.Coli fu identificata
utilizzando degli esperimenti di DNA ricombinante, e si osservò che la
sequenza minima che corrispondeva ad “oriC” era una sequenza lunga
245 paia di basi.
E andando a studiare in dettaglio i tipi di sequenze presenti all'interno
di queste 245 paia di basi si osservò che erano presenti delle sequenze
ripetute più volte, in particolare furono trovate 5 copie di una sequenza
lunga 9 nucleotidi sempre uguali.
Furono poi trovate altre 3 sequenze lunghe 13 nucleotidi, dove la
sequenza non era ripetuta correttamente, però queste tre sequenze
avevano una caratteristica particolare, cioè erano ricche di adenina e
timina e nello schema sono indicate con le sequenze LMR.
I quadratini rossi stanno ad indicare un'altra sequenza che presenta un
numero elevato di copie, aventi la lunghezza totale di 14 copie della
sequenza GATC.
L’iniziatore fu identificato nella proteina DnaA
(mediante gli esperimenti sui mutanti temperatura-sensibili)

La proteina DnaA si lega alle sequenze di 9 bp

Il legame della proteina DnaA provoca l’apertura delle

sequenze di 13 bp (ricche in A-T)
Sempre utilizzando gli strumenti di isolamento di mutanti con difetti
nel processo di replicazione fu identificata la proteina responsabile
dell'inizio cioè l’iniziatore e venne chiamata DNAA.
Questa proteina è stata a lungo studiata e si è scoperto che è in grado
di legarsi alle sequenze di 9 paia di basi che erano state identificati
all'interno di “oriC” e legandosi a queste sequenze di 9 paia di basi in
più copie, il legame della proteina DNAA a queste sequenze ha l'effetto
di provocare una distorsione nel DNA stesso e a seguito di questa
discussione conformazionale quello che si ottiene è l'apertura delle
regioni di 13 paia di basi, che erano delle sequenze ricche di adenina e
timina.
Adenina e timina sono in grado di formare tra loro solo due legami
idrogeno e risultano più facili da denaturare, quindi l'energia richiesta
per poterle denaturare è più bassa, ed è sufficiente questa distorsione
strutturale indotta dalla proteina DNAA per provocare l'apertura.
La proteina DNA è una proteina che lega l'ATP e di conseguenza si lega
al DNA della sua forma complessata con l'ATP e l'idrolisi di questo ATP
è necessario per la regolazione di processo. 
 Dopo l’apertura del doppio filamento la DNA Elicasi (DnaB)
si lega grazie al caricatore dell’elicasi (DnaC) la cui
attività è ATP-dipendente

L’idrolisi di ATP da
parte di DnaC è
necessaria per
caricare DnaB sul
singolo filamento

+ATP

L’Elicasi inizia la
sua attività e la
SSB si lega ai
singoli filamenti
(non mostrata
nell’immagine)
Questa iniziale apertura del doppio filamento permette il legame di un
complesso formato dalla DNA Elicasi (DNAB) è un'altra proteina anch'essa in
forma  isamerica che viene detta caricatore della DNA Elicasi o DNAC, e la
funzione di questa proteina è quella di aiutare il legame dell'Elicasi al DNA.
Fa questa operazione utilizzando soltanto l'Idrolisi dell'ATP che presenta un
meccanismo a quello che riguarda il caricatore della pinza Beta sul DNA.
Quindi la proteina DNAC è legata all’ATP e in questa forma si lega la DNAB.
Quando l'ATP viene idrolizzato questo crea un cambiamento conformazionale
in DNAC che viene trasmesso anche a DNAB, e DNA B come conseguenza di
questo è in grado di aprirsi e legarsi intorno al filamento del DNA. Una volta
avvenuto questo il DNAC ci si dissocia e DNAB rimane legata al singolo
filamento del DNA ovviamente ci sono due copie per ciascuna di queste
proteine perché è una Elicasi si lega su un filamento l'altra Elicasi si lega
sull'altro filamento.
Una volta che l’Elicasi inizia a funzionare, si forma un tratto di DNA singolo
filamento che viene immediatamente legato dalle proteine SSB per evitare la
chiusura del filamento stesso.
 La Primasi si associa all’Elicasi e inizia la sintesi dei
primer dei filamenti «leading»

La DNA
Polimerasi
inizia la sintesi
sui filamenti
«leading»
 Una volta che l’Elicasi si è associata e ha iniziato a svolgere la sua
attività, nel doppio filamento di DNA si può associare anche la Primasi. 
La Primasi si associa direttamente all’Elicasi e inizia a sintetizzare il
primer, e man mano che l’Elicasi si muove, troviamo due Elicasi che si
muovono una nella direzione specifica e con la Primasi associata
avviene la sintesi dei primi primer che sono quelli dei filamenti
“leading”, cioè i filamenti che poi saranno sintetizzati in maniera
continua.
Lo step successivo è quello del legame con l’oloenzima della DNA
polimerasi III, che si associa ai primi primer che sono stati sintetizzati
sui filamenti leading e comincia ad allungare questi filamenti.
Questi due oloenzima sono ognuno responsabili del filamento in una
direzione, quindi si legano al loro filamento guida e si muovono nelle
due direzioni facendo aumentare le dimensioni di questa bolla di
replicazione, andando a costituire le due forche di replicazione.
….e prosegue sui filamenti «lagging»
Viene sintetizzato anche il primo primer sul filamento “lagging” e una
seconda copia di Sliding Clamp si va ad associare, in modo tale che la
seconda copia di polimerasi per ognuno delle due forche posso iniziare
la sintesi del primo frammento di Okazaki.
 L’inizio della replicazione deve avvenire solo
una volta per ciclo cellulare

DnaA (52 kDa) = proteina iniziatrice

livello costante di DnaA nella cellula:1000-2000/cellula

DnaA-ATP prima dell’inizio della replicazione DnaA attiva

DnaA-ATP
dopo l’inizio della replicazione DnaA inattiva
DnaA-ADP
Abbiamo visto come avviene il
riconoscimento dell'origine di
replicazione, come in corrispondenza di
questa origine
si forma una bolla di replicazione e quindi
due forche di replicazione e in
corrispondenza di queste forche si vadano
ad associare in sequenza tutte le proteine
che devono iniziare la sintesi e partecipare
al processo di replicazione.
Questa serie di eventi è regolata, perchè
questo inizio di replicazione deve avvenire
soltanto una volta per ogni ciclo cellulare,
quindi solo prima che la cellula si divide il
DNA deve essere replicato.
Quindi ci deve essere un qualche
meccanismo che regola la secrezione del
sito di origine di replicazione.
Quindi gli studi sul DNAA che è una
proteina da 50 kDa  hanno dimostrato che
la quantità di queste proteine all'interno
della cellula è sempre costante, quindi ci
deve essere un meccanismo che impedisce
che un origine di replicazione che sia stata
appena riconosciuta e quindi che abbia
dato inizio alla sintesi dei nuovi frammenti
non possa essere riconosciuta di nuovo.
Infatti abbiamo detto che la DNAA per
legarsi ai suoi siti di legame sull'origine
deve essere associata all’ATP.
Quindi anche se la quantità totale di DNAA
all'interno della cellula è costante non
cambia e quello che varia è la quantità di
DNAA associata all’ATP.
Quello che si è visto è che prima dell'inizio
della replicazione la quantità è molto
elevata DNAA-ATP e questa è la forma di
DNAA “attiva” per l'inizio della replicazione
e subito dopo l'inizio l'ATP  viene
idrolizzato e quindi si accumula nella
cellula una forma di DNAA legata all’ADP
che rimanendo in questo stato è una in una
forma “inattiva”.
 si lega a oriC
ATP-DnaA
(attiva)

Inizio della replicazione

ADP-releasing factor

Divisione cellulare
Attivazione della polimerasi
legame della subunità β a DnaA
(sliding clamp)
Lo scambio del nucleotide
per rimpiazzare l’ATP
dipende dal passaggio Formazione del complesso RIDA
attraverso la successiva
divisione cellulare, e la ADP-DnaA RIDA:
cellula passa attraverso (inattiva) Regulatory Inactivation of DnaA
un periodo di eclisse
durante il quale non si
verificano nuovi eventi
Questo complesso (subunità β,
d’inizio DnaA e IdaB (inhibitor of DnaA)
stimola l’idrolisi dell’ATP.
 La proteina DNAA rimane in questa sua forma “attiva” fino a quando
non è avvenuta la divisione cellulare.
Questo perché lo scambio del nucleotide ADP con una nuova molecola
di ATP dipende da un fattore di un ATP “releasing factor” cioè un fattore
che promuove il rilascio della ADP, la cui attività è direttamente
dipendente dal passaggio attraverso la divisione cellulare.
E la proteina DNAA rimane “inattiva” durante questo periodo che è
detto di “eclisse” durante il quale non si possono verificare nuovi eventi
di inizio della replicazione.
Meccanismi che “rinforzano” l’eclipse period

1- “Titolazione “ di DnaA

Sono presenti numerose sequenze di legame per DnaA

(DatA) in altri punti del cromosoma non distanti da OriC
che la legano con una affinità ridotta rispetto ad OriC
(affinità ~ ½ oriC)

Dopo l’inizio della duplicazione la quantità di questi siti

raddoppia!!

2- Sequenze GATC (14/245 bp)

Questo periodo di “eclisse” viene
mantenuto anche da altri meccanismi,
questo perché la quantità di proteina
DNAA presenti all'interno della cellula è
maggiore rispetto a una quantità che si
può legare in corrispondenza del sito di
origine e di conseguenza anche se le
copie di DNAA che sono state occupate a
innescare un evento di inizio, sono
momentaneamente inattivate, ce n'è
potrebbero essere altre all'interno della
cellula disponibili ad andarsi a legare.
Quindi il periodo di “eclisse” deve essere
regolato anche in altro modo, e cioè sul
fatto che oltre alle sequenze presenti
all'interno di “oriC” cioè sequenze in
grado di legare la proteina DNAA, ne
esistono altre per le quali la proteina ha
un’ affinità minore quindi normalmente si
va a legare ad “oriC”, ma le copie in più di
DNAA possono anche andarsi a legare a
questi altri siti che si trovano in altri punti.
Quindi la proteina è occupata a legare
altre sequenze per le quali ha un’ affinità
anche se ridotta rispetto ad “oriC”, ma non
solo perché  la posizione di queste
sequenze sul cromosoma si trova è vicina
ad “oriC”, quindi questo vuol dire che una
volta che si è formata la bolla, le forche di
replicazione iniziano a sintetizzare e
duplicano proprio queste regioni che
quindi si ritrovano dopo un breve tempo
dall’ inizio della duplicazione ad essere
raddoppiate, ci sono due copie di ciascuno
di questi siti e quindi aumenta il numero di
siti che sono in grado di legare DNA.
Il secondo meccanismo è legato alle
sequenze GATC di cui sono presenti circa
14 copie nelle 245 coppie di basi che
compongono “oriC”.
Nel DNA sono presenti dei nucleotidi modificati
La Metilazione da parte di enzimi metil-trasferasi è post-sintetica

Solo nei procarioti

Procarioti ed
eucarioti

5-metilCitosina
Nel DNA possono essere presenti alcuni nucleotidi modificati.
In particolare quelli più abbondanti, sono dei nucleotidi metilati e cioè
l’adenina metilata sull'azoto è legato alla posizione 6 e quindi si parla
di 6-metiladenina e la citosina metilata alla posizione 5 dell' anello
pirimidinico.
Quindi 6-metiladenina e 5-metilcitosina sono presenti all'interno del
DNA e sono delle modificazioni post-sintetiche, cioè queste basi
vengono metilati quando già si trovano all'interno del DNA, quindi non
vengono incorporati dalla Polimerasi-Nucleotidi-Metilati ma devono
essere metilati dopo la sintesi del DNA.
La metilazione della A avviene sulla sequenza GATC

metilazione di GATC
in corrispondenza di oriC
avviene con ritardo
rispetto al resto del
cromosoma (10 min)
Questa metilazione avviene quando le due La DNA polimerasi copia il filamento
basi cioè l'adenina e la citosina si trovano complementare, e in un momento
all'interno di particolari sequenze che successivo interverrà la Dam-Metilasi per
vengono riconosciute da enzimi specifici, rimetilare questi siti che sono
e questi enzimi sono in grado di “emimetilati”, quindi i siti “emimetilati”
aggiungere il gruppo metilico. non durano a lungo, in genere vengono
La metilazione dell'adenina può avvenire rimetilati molto velocemente. 
all'interno di diversi tipi di sequenza una In corrispondenza di “oriC” ci sono 14
di queste è proprio la sequenza GATC. sequenze GATC, quindi queste sequenze,
Le sequenze GATC all'interno del una volta iniziato il ciclo di replicazione
cromosoma vengono riconosciute da un diventano tutte “emimetilate”.
enzima che si chiama Dam-Metilasi che è Quello che si è notato con gli esperimenti,
in grado di metilare il residuo di adenina. è che mentre tutte le sequenze GATC
Come abbiamo detto è una modifica post- presenti nel resto del cromosoma vengono
sintetica quindi avviene dopo che il DNA è rimetilate immediatamente nel giro di
stato sintetizzato, e questo vuol che la brevissimo tempo le sequenze che sono
sequenza metilata viene replicata, e si presenti in corrispondenza di “oriC” vengo
troverà per un certo lasso di tempo in uno metilate con ritardo, dopo 10 minuti.
stato “emimetilato” perché la DNA
polimerasi non è in grado di incorporare
nucleotidi che siano già metilati.
-oriC emimetilato non è attivo
nell’inizio della duplicazione

-oriC emimetilato si lega alla

membrana

-il sito emimetilato viene

sequestrato da una proteina di
membrana: SeqA
Si è arrivati a scoprire che questo “oriC” rimane emimetilato per un
certo periodo,
e quando si trova nello stato emimetilato non è attivo per l'inizio della
duplicazione.
L’ “oriC” emimetilato è stato ritrovato associato alla membrana.
In particolare si è visto che una proteina di membrana che è stata
chiamata “SeqA” è in grado di legare questi siti emimetilati. Ma se la
proteina SeqA si trova all'interno della membrana, questi siti
emimetilati vengono associati alla membrana e di conseguenza non
sono disponibili per un nuovo evento di inizio della replicazione.
Questo spiega anche perché non vengono metilati, perché sono
associati a questa proteina SeqA.
Quindi alla membrana non sono disponibili ne per il DNA per eventuale
nuovo inizio, ma neanche per la Metilasi che dovrebbe metilare il
nuovo filamento.
Solo a un certo punto c'è un segnale che permette la dissociazione di
questa regione del DNA dalla proteina SeqA, e quindi quando si
dissocia il DNA dalla SeqA, la metilasi può intervenire per rimetilare
l'altro filamento e il DNAA può andare a legarsi per innescare un nuovo
inizio di replicazione.
Legame di oriC emimetilato alla membrana (10 min)

Siti di legame per DnaA (duplicati dopo ca. 8 min)

Sistema RIDA

Tutti e tre i sistemi sono accoppiati con il processo di

replicazione
Tutti questi tre meccanismi cooperano per mantenere questo tempo di
“eclisse”.
O sottraendo il sito “oriC” all’azione degli enzimi della DNAA o
riducendo la quantità di DNAA disponibile per andare a riconoscere un
nuovo sito di origine.
Tutti e tre sistemi sono direttamente correlati con il processo di
replicazione.
 A-Basic structure of oriC B-Model of the initiation complex

Duplex Unwinding Element DnaA Oligomerization Region

Nucleic Acids Research, Volume 47, Issue 21, 02 December 2019, Pages 11209–11224, https://doi.org/10.1093/nar/gkz795
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Abbiamo in A la rappresentazione di “oriC” con le tre sequenze LMR che sono definite
“duplex unwinding element” cioè sono le regioni ricche di A-T, mentre l'altra regione
è denominata “DnaA oligomerization region”.
Lo spazio colorato con le frecce nere diciamo sono quelle che presentano
effettivamente la sequenza, mentre quelle grigie non sono perfettamente identiche
alla sequenza, con la direzione delle frecce viene indicata anche la direzione della
sequenza sul filamento di DNA e che a sua volta indica in quale direzione si legherà la
proteina. 
In B troviamo un modello di come la proteina si leghi su tutte queste regioni e porti
quindi all’ apertura nel doppio filamento.
Interviene anche un altra proteina chiamata IHF che si lega a quella sequenza indicata
in verde su “oriC” ed è una proteina che è in grado di piegare il DNA e questo
ripiegamento  fa sì che le proteine DNA che sono legate alle sequenze che sono
indicati in verde, possono contemporaneamente anche legarsi al DNA che si sta
denaturando.
Le sequenze riconosciute da DNA indicate con le frecce potremmo dividerle in due
blocchi  a seconda della direzione della freccia ovvero della direzione in cui è disposta
la sequenza sul DNA.
Quello che si è scoperto attraverso il sistema “factor” è che le proteine che legano
l’ATP, che poi viene idrolizzato necessitano di fattori che nella maggior parte dei casi
sono dei fattori proteici che permettono il rilascio della ADP e il legame nuovamente
dell’ATP. E nel caso di DNA non è così.
Modeling of molecular dynamics in DARS-DnaA complexes

DARS: DnaA Reactivating Sequences

Il legame di DnaA alle sequenze DARS

è regolato temporalmente da altre due
proteine IHF e Fis

Nucleic Acids Research, Volume 47, Issue 21, 02 December 2019, Pages 11209–11224, https://doi.org/10.1093/nar/gkz795
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Esistono delle sequenze che sono definite DARS (= DnaA reactivating sequences) ne
esistono due (DARS1 e DARS2).
Queste sequenze DARS sono costituite da tre ripetizioni delle stesse sequenze di 9
nucleotidi che si trovano in “oriC”. 
Come notiamo dalla disposizione delle frecce, che nel caso precedente dove i due
blocchi e  le frecce andavano nelle stesse direzioni, permettevano alla proteina di
legarsi andando sempre nella stessa direzione, mentre in questo caso le frecce sono
in direzione opposta e questo vuol dire che la proteina si lega in modo diverso,
fronteggiandosi in questa zona che presenta un incavo nel quale è legata la pallina
azzurra e l’ADP, con questa faccia della proteina notiamo due facce che si
fronteggiano nell'immagine inferiore.
Proprio questo legame con il contatto che è indicato tra le frecce rosse delle prime
due copie quelle più a sinistra, questa conformazione che viene chiamata “head-to-
head” che fa sì che le due proteine subiscono un cambiamento conformazionale che
porta al rilascio della ADP e una volta rilasciato l’ADP, l'ATP siccome è molto più
abbondante all'interno della cellula si va a legare alla proteina.
Quindi è un caso in cui lo scambio dei nucleotidi cioè lo scambio tra ADP e ATP non è
immediato da un'altra proteina ma è mediato dalla sequenza di un’altro DNA.
Ci sono altre due proteine che intervengono chiamate IHF e FIS (=che vanno a
regolare questo meccanismo temporalmente, quindi determinano il momento esatto
in cui il DNA può andarsi a legare a quelle sequenze).
Terminazione della replicazione
In corrispondenza delle origini, i filamenti si aprono e si assemblano i
complessi di tutti gli enzimi che partecipano alla replicazione.
Le forche di replicazione si muovono bidirezionalmente,ci sono due
forche, una in una direzione e una nell'altra e queste due forche che
incontreranno esattamente nella posizione opposta rispetto all'origine
sul cromosoma di Escherichia Coli, e li si verificherà  la terminazione
della replicazione.
La forca di replicazione 1, va a fermarsi in corrispondenza delle
sequenze dette “terE,D,A” che si trovano oltre il punto centrale dove le
tue forze si potrebbero incontrare, quindi quelle sequenze
determinano la terminazione della forca numero 1, mentre la forca
numero 2 termina in corrispondenza delle sequenze “terC,B”.
E sono indicate anche le cinque sequenze conservate.
Una delle proteine che va a partecipare alla terminazione, è una
proteina che si chiama “Tus” e si va a legare  a queste sequenze “ter”.
Ha una struttura concava per cui si lega in modo asimmetrico e riesce a
bloccare la replicazione.
Bloccando l'avanzamento delle Elicasi, si blocca anche la replicazione.
Separazione tra i
cromosomi replicati
Alla fine di tutto il processo della duplicazione i due cromosomi si
trovano tra loro concatenati.
Quindi è necessario l'intervento di una topoisomerasi di tipo 2.
Sarà la topoisomerasi  4 che interviene tagliando uno dei due
cromosomi, tagliando tutti e due filamenti perché è di tipo 2 e lasciando
passare un cromosoma attraverso l'interruzione prodotta nell'altro,
quindi che si otterrà la separazione tra i due cromosomi.
Replicazione e ciclo cellulare nei batteri

C = Tempo necessario per la replicazione

del cromosoma = 40’
(50.000bp/min)

D = Tempo che intercorre fra il

completamento di un ciclo di replicazione
e la divisione cellulare = 20’

C + D = 60’

Batteri che si dividono velocemente

“doubling time” = 20’

il rapporto massa cellulare/n.° di origini

è costante

regolazione positiva: accumulo di DnaA

 Vediamo che relazione c'è tra la replicazione e il ciclo cellulare nei batteri. 
Abbiamo parlato della velocità a cui viaggiano le forche di replicazione che corrisponde
a circa 50000 paia di basi al minuto, va data la lunghezza del cromosoma, e questo ci
dà un tempo necessario per la replicazione del cromosoma che è pari a 40 minuti.
Terminata la replicazione, la divisione cellulare si conclude 20 minuti dopo.
Quindi il tempo completo che dall'inizio della replicazione fino alla fine della divisione
cellulare sarebbe di 60 minuti.
In realtà sappiamo che i batteri possono dividersi più velocemente, e quindi possiamo
avere un tempo di raddoppio e di divisione di circa 20 minuti.
Come vediamo nelle immagini è possibile che inizi il secondo ciclo di duplicazione
quando ancora il primo non è terminato, portando alla formazione di quelli che sono
stati definiti come cromosomi multi-forche.
La duplicazione di un primo ciclo di replicazione (colore rosso più chiaro) è arrivato in
quel punto, ma non ha ancora completato l’intera duplicazione. 
Quindi l’intero cromosoma, inizia nuovamente il riconoscimento delle forche e la
formazione di una nuova bolla di replicazione in corrispondenza dell'origine.
Tutto questo sembra essere regolato dalla massa cellulare, ed è stato osservato il
rapporto tra la massa e il numero di origini che rimane costante, quindi quando la
massa cellulare raggiunge un certo valore puoi iniziare la Nuova Divisione e questo è
anche regolato dall’ accumulo della proteina DNAA attiva che è in grado di andare a
riconoscere nuovamente l'origine e iniziare un nuovo ciclo in un determinato
momento, anche se il ciclo precedente di replicazione non si è completato.
Nell’immagine troviamo la formazione della bolla di replicazione e
come avanzano le due forche di replicazione in direzione opposta.
Ciascuna delle due forche ovviamente avrà un filamento “leading” e un
filamento “lagging” che però diciamo sono opposte nelle due forche,
infatti con la freccia rossa (leading) sono indicate quelle in basso per la
forca di sinistra è quello in alto per la forca di destra e viceversa quello
(laggingin)in  basso per la forca di destra e quello in alto per la forca di
sinistra, questo perchè i filamenti sono antiparalleli.
E siccome le due forche si muovono nelle direzioni opposte, la
posizione dei filamenti continui deve essere quella opposta nelle due
forche.