Meccanismi di resistenza dei Gram- ai

betalattamici

Inattivazione dell’antibiotico:
Produzione di enzimi idrolizzanti (β-lattamasi)

Diminuita concentrazione intracellulare da ridotto

influsso:
Ridotta permeabilità della membrana

Diminuzione affinità PBP (Penicillin Binding Protein)

 Le -lattamasi sono enzimi in grado di idrolizzare
l’anello -lattamico degli antibiotici -lattamici
portando alla formazione di un derivato inattivo.

Nelle Enterobacteriaceae il controllo genetico

di tali enzimi è prevalentemente plasmidico.

possibilità di
trasferimento genico
orrizzontale.
Le β-lattamasi vengono classificate secondo due schemi:

 Ambler le β-lattamasi vengono divise in 4 classi

molecolari a seconda della sequenza amminoacidica.
- Classe A, C, D : sono β-lattamasi seriniche hanno tutte un
residuo di serina nel sito
- Classe B: sono metallo β-lattamasi. Richiede la
presenza di zinco nel sito attivo come co-fattore

• Bush, Medeiros, Jacoby β-lattamasi vengono

suddivise in 4 gruppi funzionali (numerati da 1 a 4) e in
diversi sottogruppi (indicati con lettere) basandosi
sull’attività degli enzimi verso differenti substrati e sulla
loro sensibilità agli inibitori.
Non esiste una definizione universalmente condivisa del
termine ESBL.

Enzimi di classe molecolare A che idrolizzano

anche le cefalosporine di 3° e 4°, i monobattami e
sono inibite dagli inibitori delle β-lattamasi; ma non
attaccano i carbapenemi e le cefamicine.

I principali tipi di ESBL sono:

 TEM
 SHV
 CTX-M
TEM e SHV

derivano dalle β-lattamasi classiche ( TEM-1, TEM-2

e SHV-1), in seguito a sostituzioni amminoacidiche
che ne ampliano lo spettro d’azione.

CTX-M
sono diversi da un punto di vista genetico dagli
enzimi TEM e SHV ma presentano una forte
omologia con gli enzimi AmpC codificati a livello
cromosomico da Kluyvera ascorbata dai quali
originano.
sono caratterizzati da una maggiore attività
idrolitica verso il cefotaxime (CTX), da cui il nome
CTX-M, ed il ceftriaxone, piuttosto che verso il
ceftazidime (CAZ).
 ESBL : l’individuazione fenotipica

La rilevazione delle ESBL prevede 2 passaggi

successivi:

 un test di screening per identificare gli isolati

potenzialmente produttori di ESBL MIC ≥ 2 per
almeno una cefalosporina di terza generazione o per
aztreonam

 un test di conferma da effettuare sui ceppi

risultati positivi al test di screening es : Test di
combinazione
Test di combinazione (diffusione da
disco)
Ceftazidime Viene considerato
Clavulanato significativo per la
Ceftazidime produzione di ESBL un
aumento ≥ 5 mm del
diametro dell’alone di
inibizione per anche solo
uno degli antibiotici
testati in combinazione
con l’acido clavulanico
rispetto alla stessa
Cefotaxime Cefotaxime molecola testata
Clavulanato
individualmente.
 Etest - ESBL

ESBL+ zona fantasma

ESBL+ rapporto MIC:TZ/TZL e CT/CTL8
CT: cefotaxime, CTL:Cefotaxime +
clavulanic acid, TZ:ceftazidime, TZL
ceftazidime+ clavulanic acid

ESBL negativo ESBL+ deformazione ellissi

 ESBL : la caratterizzazione
molecolare

I principali tipi di ESBL sono:

TEM derivano dalle -lattamasi classiche ( TEM-1, TEM-2 e SHV-1), in

seguito a sostituzioni amminoacidiche che ne ampliano lo spettro
SHV d’azione. Oggi TEM 223, SHV 193 www.lahey.org/studies

CTX-M: -lattamasi a spettro esteso (ESBL) non-TEM, non-SHV,

originate da enzimi cromosomici di Kluyvera spp. Oggi 172 varianti di CTX-M
Analisi genotipica (PCR)

Vengono condotte delle reazioni di PCR,

utilizzando come templato il DNA genomico, per
confermare la presenza nei nostri ceppi di un gene
che codifica per una ESBL: blaTEM

blaSHV, blaCTX-M
1079 pb
930 pb 600 pb
 pb 1 2 3 4 5 6 7 8

1500

1000
1079
Amplificazione mediante
930
PCR dei geni blaTEM e blaSHV
500

1 2 3 4 5 6 7 8
bp

1000

600
Amplificazione mediante PCR
del gene blaCTX-M.
200

100
 Sequenziamento

Poiché le diverse varianti di ESBL differiscono tra

loro e dagli enzimi da cui derivano anche solo x
poche mutazioni, la conferma molecolare richiede,
in via conclusiva il sequenziamento completo del
gene.
SEQUENZIAMENTO

Un motore di ricerca
individua e restituisce le
sequenze presenti in
GenBank che hanno il più
elevato grado di somiglianza
con la sequenza in esame
 AmpC
 Fino al 1990 reperite esclusivamente sul
cromosoma
Serratia
Citrobacter
Enterobacter
 Dal 1990 trovati i geni per AmpC su plasmidi (E.
coli, Klebsiella e Proteus )

 La produzione di questo enzima può essere sia

costitutiva (permanente) sia inducibile
(transitoria), avviene solo in presenza
dell'antibiotico
 AmpC

Cromosoma Plasmide

Costitutiva/
inducibile  Escherichia coli
 Klebsiella
pneumoniae
 Proteus mirabilis
 Enterobacter cloacae  altri
 Citrobacter freundii
 Serratia spp.
 Morganella morganii
 Providencia spp.
 AmpC-plasmidiche
 Non inibiti dagli inibitori delle -lattamasi
 Acido clavulanico
 Sulbactam
 Tazobactam
 Resistenti a :
 Cefalosporine di prima, seconda e terza generazione
Monobattami (p.es. Aztreonam)

 Sensibili ai carbapenemi ed alle cefalosporine di quarta

generazione (cefepime)
AmpC : l’individuazione fenotipica
•Test con inibitori
•Test con induttori
Nuovo Ospedale Civile S.Agostino-Estense
E. coli ceppo selvaggio
Laboratorio di Microbiologia

A.clavulanico A.clavulanico

A.boronico A.boronico
Nuovo Ospedale Civile S.Agostino-Estense
Laboratorio di Microbiologia P. mirabilis ESBL +

A.clavulanico A.clavulanico
Nuovo Ospedale Civile S.Agostino-Estense
Laboratorio di Microbiologia P. mirabilis non ESBL (AmpC)

 < 5mm

 > 5mm

acido boronico
 AmpC :la caratterizzazione
molecolare
Primer per l’amplificazione dei geni AmpC

Magior plasmid- Cicling No of Expected

Prmer name Sequenze (5’-3’) mediated CBL lineare condition cyclcs amplicon
or target size(pb)

AmpC/I_Fw GATGGCAARGCCCACTAYTTC CMY-MOX D94/1 A52/1 E72/1 35 917

AmpC/I_Rev TTGGCCAGCATGACGATG FOXb
AmpC/II_Fw CAGGCYATTCCGGGTATGG CMY/LAT,ACT,MIR D94/1 A52/1 E72/1 35 763
AmpC/II_Rev GCCAGTTVAGCATYTCCCAG
AmpC/III_Fw CATTAAACCGCTGATGGCAC DHA/MOR D94/1 A52/1 E72/1 35 1,008
AmpC/III_Rev GCTTTGACTCTTTCGGTATTCG
AmpC/IV_Fw AAGGTGCTCTGGCTGCTAATATC ACC D94/1 A52/1 E72/1 35 1,094
AmpC/IV_Rev TTCCAATGAGCTCAGGATTTTATAC
CMY/F GGGCCCGGACACCYTTTTGC blaCMY-2 like genes D94/1 A49/1 E72/1 35 1,256
CMY/R TAAGTGTAGATGACARCAGG
CMY_Exp_Fw GCTCTAGACATATGATGAAAAAATCGTTATGCTG blaCMY-16 D94/1 A53/1 E72/1 35 1,165
CMY_Exp_Rev CGGGATCCTTATTGCAGCTTTTCAAGAATG

Amplificazione mediante PCR del

gene CMY/LAT
 Amplificazione mediante PCR del gene
blaCMY-16 e del gene blaCMY-2like

1500
blaCMY-2-like
1500
blaCMY-16

1165

1265
 CARBAPENEMASI

Produzione di carbapenemasi:
– β-lattamasi inibite dall’ac. clavulanico (classe A)
– Metallo-β-lattamasi (classe B)
– Oxacillinasi a spettro esteso (classe D)
 CARPBAPENEMASI

BATTERI PRODUTTORI
CLASSIFICAZIONE ENZIMA
PIU’COMUNI
Class A KPC, SME, Enterobacteriaceae (rari

IMI, NMC, casi in P. aeruginosa)

GES
Class B IMP, VIM, P. aeruginosa
(metallo-β- NDM, GIM, Enterobacteriaceae
lactamse) SPM
Acinetobacter spp.

Class D OXA Acinetobacter spp.

 LA DIFFUSIONE DELLE CARBAPENEMASI
KPC: carbapenemasi di classe A
• Identificate inizialmente in
Klebsiella pneumoniae (1˚ isolamento
nel 1996, USA), questi enzimi sono
attualmente descritti in altri membri
della famiglia delle
Enterobacteriaceae: Klebsiella
oxytoca, Salmonella enterica,
Escherichia coli, Citrobacter
freundii, Enterobacter spp., e
Serratia marcescens.
• Il gene che codifica per le KPC si
trova su elementi genetici mobili
(trasposoni), ciò aumenta il rischio di
trasmissione.
• KPC è divenuto presto endemico in
alcuni stati degli USA, America del
Sud, Cina, Israele, Grecia. In Italia è
stata raggiunta l’endemia di alto
livello in pochi anni
 LA DIFFUSIONE DELLE CARBAPENEMASI
Metallo-β-lactamase
.
•Sono state descritte originariamente in
Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp. e,
più recentemente, tra le
Enterobacteriaceae.
•Le più comuni carbapemenemasi di classe
B sono quelle di tipo VIM.
•1˚ VIM è stata isolata nel 1997 a
Verona in P.aeruginosa
•Le VIM sonostate rilevate in tutto il
mondo ma sono più frequenti nel Sud
Europa.
•In Italia si sono registrate epidemie
locali e diversi isolamenti sporadici
 LA DIFFUSIONE DELLE CARBAPENEMASI
NEW-DELHI METALLO Β-LATTAMASI
• Nel 2009 fu isolata una nuova
carbapenemasi, in Klebsiella pneumoniae
rilevata in un paziente svedese, ricoverato
precedentemente a New Delhi.
• Sono associate prevalentemente con storie
di viaggi e ricoveri nel sub continente
indiano (turismo sanitario), dove questi
microrganismi sono endemici.
• NDM-1 è stata rilevato in molti paesi (UK,
Cina, Australia, USA, Canada, Europa–
Balcani in particolare).
• L’indagine epidemiologica dimostra che
molti di questi casi sono riconducibili al
sub continente indiano. Nel tempo sono
emerse nel mondo nuove varianti di NDM,
identificate con numeri progressivi.
• In Italia si rilevano micro epidemie locali e
isolati sporadici.
 LA DIFFUSIONE DELLE CARBAPENEMASI
OXACILLINASE

Sono frequenti in Acinetobacter spp.

(soprattutto OXA-23, 24, 58, 143) e in
Pseudomonas aeruginosa.
•1˚ isolato di OXA-48 in Enterobacteriaceae nel
2001 in Turchia.
•A seguire OXA-48 è stata isolata in molti paesi
del Mediterraneo (Israele, Tunisia, Marocco,
Spagna, Francia).
•L’emergenza dei casi nei paesi europei è stata
associata alla mobilità dei pazienti da una
struttura sanitaria all’altra.
•In Italia circolazione (inizialmente) sporadica. Al
momento non si può parlare di endemia.
 Quando sospettare la produzione di
carbapenemasi?

meropenem MIC ≥ 0.5 mg/L o

diametro alone di inibizione ≤ 32 mm
qualora il meropenem non venga saggiato può essere
considerato indicativo lo stesso valore di MIC per
l’imipenem tranne che per: Proteus spp., Morganella
morganii, Providencia spp. (queste specie
microbiche possono avere MIC elevate per
imipenem indipendentemente dalla produzione di
carbapenemasi)
 Test di sinergia con acido boronico
Quali test utilizzare per la conferma
fenotipicatica?

•Test di sinergia con acido boronico

•Test di sinergia con EDTA o acido dipicolinico

•Test di Hodge (modificato)

 Test di sinergia con ac. Boronico, EDTA o ac. dipicolinico
Posizionare su una piastra di Mueller-Hinton agar, preventivamente seminata con
il ceppo da testare (sospensione 0,5 McFarland ) i seguenti dischetti:
Meropenem
Meropenem + a. boronico
Meropenem + EDTA o a. dipicolinico
 Incubare in a 37°C per 18-24 ore.

Per EDTA ed a. dipicolinico viene considerato significativo un aumento

dell’alone di inibizione del meropenem ≥ 5 mm mentre per l’acido
boronico è sufficiente un aumento ≥ 4 mm.
• La sinergia con acido boronico è indicativa della presenza di KPC o, più
raramente, di altre carbapenemasi di classe A.
• La sinergia con solo acido dipicolinico o EDTA è indicativa della presenza di
metallo-beta-lattamasi.
E’ importante effettuare sempre il di Controllo Qualità utilizzando i seguenti ceppi:
Controllo negativo: E. coli ATCC 25922
Controlli Positivi: K. pneumoniae ATCC 13438 (KPC +)
K. pneumoniae ATCC 13438 (MBL +)
 MBL POSITIVA

MEROPENEM MEROPENEM
+ EDTA MEROPENEM + BOR
 Test di Hodge modificato
Si basa sulla riduzione dell’attività del carbapenemico
saggiato nei confronti di un ceppo indicatore sensibile
mediata dalla carbapenemasi prodotta dal microrganismo in
esame.
Il test è da definire negativo se l’alone di inibizione del
ceppo di controllo NON presenta una evidente rientranza in
corrispondenza dell’inoculo del ceppo saggiato
Il test è positivo se l’alone d’inibizione del ceppo di controllo
intorno al dischetto di carbapenemico presenta una
rientranza per crescita interna in corrispondenza della
strisciata dello stipite da testare
Test di Hodge
modificato

ATCC 25922

3
Alone di
inibizione
1
2

Alone di
inibizione
modificato indica
la presenza di
carbapenemasi
 Phenotypic tests for MBL detection

IPM + EDTA (750 g)

IPM

Jong et al - JCM 2002

Combo disk test
IPM + EDTA IPM

Confirmation by
Etest MBL
molecular testing
Etest MBL: sinergia tra imipenem e EDTA
Si utilizzano striscette di plastica contenenti da un lato un gradiente
di concentrazione di imipenem (4-256 µµg/ml) e dall’altra un
gradiente di concentrazione di imipenem (1-64 µg/ml) e una quantità
costante di EDTA

IL TEST RISULTA POSITIVO SE:

• MIC IP/IPI >8
• deformazioni dell’ellissi

Imipenem + EDTA Imipenem

 Analisi genotipica (PCR)

Sono state condotte delle reazioni di PCR, utilizzando

come templato il DNA genomico, per confermare la
presenza di un gene che codifica per metallo -lattamasi
blaVIM blaIMP

500 bp, 400 bp,

 Amplificazione mediante PCR
dei geni blaVIM e blaIPM

1500
1500
1000
500
500
400
ITALIA 2009-2014

2012 2014
28,8% 32,9%
 MISURE DI SORVEGLIANZA E PREVENZIONE
Regione Emilia-Romagna
Predisposizione raccomandazioni
Enterobatteri produttori di
carbapenemasi
Come affrontare il problema in ospedale?

• identificare tempestivamente i
casi di infezioni clinicamente
manifeste
• Identificare i pazienti colonizzati
(tramite tampone rettale)
• adottare tempestivamente
misure
stringenti di contenimento della
diffusione (isolamento, igiene delle
mani, pulizia e decontaminazione
ambientale, ecc.)
 Programma di sorveglianza

Screnning in ingresso

• Pazienti nuovi entrati provenienti da altra struttura

ospedaliera o territoriale aziendale ed extraziendale.
• Pazienti provenienti dal domicilio che abbiano avuto nei due
mesi precedenti un ricovero presso una struttura ospedaliera.
• Pazienti provenienti dal domicilio per i quali è nota una
precedente colonizzazione.
• Tutti i pazienti ricoverati in terapia intensiva.
Nei casi suddetti lo screening deve essere effettuato in
prima giornata
È stato dunque impostato un programma di sorveglianza
attiva che prevede sostanzialmente le seguenti attività:

controllo settimanale con TR per tutti i pazienti riconosciuti colonizzati o

infetti da CPE
screening settimanale con TR dei contatti, da protrarsi sino a tre
settimane dopo la dimissione dal reparto dell’ultimo caso positivo per CPE
screening con TR effettuato dopo il ricovero per i pazienti provenienti da
altre strutture assistenziali sanitarie o socio-sanitarie (ospedali, centri di
riabilitazione o residenze per anziani) o provenienti dal domicilio ma con
ricovero in strutture assistenziali nei due mesi precedenti
tempestiva comunicazione da parte del laboratorio al coordinatore
infermieristico e agli uffici di Igiene Ospedaliera dei nuovi casi di infezione
o colonizzazione da CPE
applicazione di idonee misure atte a prevenire la diffusione del CPE per
tutti i pazienti colonizzati o infetti.
 MATERIALI E METODI
COLTURE DI SCREENING

incubate in aerobiosi a 36+/-1

°C per 18/24 ore

Test di Hodge modificato

Test di sinergia con acido boronico
Test di sinergia con EDTA o acido
dipicolinico

La caratterizzazione molecolare dei geni responsabili

della produzione di carbapenemasi (blaKPC, blaIMP , blaVIM,
blaMDM, blaOXA48) viene effettuata mediante PCR.