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Nuovo allergene da
Rhizopus oryzae
Caratteristiche molecolari ed immunologiche
Funghi ed allergie
Studio immunoproteomico
Evidenze cliniche di (2012) lo stesso gruppo di
allergenicità di questa muffa ma ricerca ha identificato 14
nessuna caratterizzazione delle allergeni (RO)
molecole allergeniche
Aspartato endopeptidasi
(44 Kda) la più allergenica
FASE I
PURIFICAZIONE
DETERMINAZION IDENTIFICAZION
ALLERGENE
E SEQUENZA AA E cDNA e
(tecniche
(PMF) CLONAGGIO
cromatografiche)
VALUTAZIONE
SAGGI ATTIVITÀ
ENZIMATICI ALLERGENICA
Reattività Rilascio
IgE istamina
FASE 2
STUDIO CROSS-
REATTIVITÀ
MAPPATURA EPITOPI
CONFORMAZIONALI
CROSS-RETTIVI
Caratteristiche cliniche dei pazienti allergici a RO scelti per lo studio
Estrazione proteine
• Coltura pura di RO in terreno
liquido (mantenuta sub-
colturando ogni 15 gg)
• Liofilizzazione – Deffating –
Omogeneizzazione in N
liquido
CROMATOGRAFIA DI AFFINITÀ
PROTEINA RICOMBINANTE
PURIFICATA
rRhi e la sua allergenicità
IgE - WESTERN BLOT
(test di immuno-reattività)
rRhi o 1 è riconosciuta da
IgE specifiche presenti nel
siero di tutti i 10 pazienti
positivi
SAGGIO RILASCIO DI
ISTAMINA
30 ng di rRhi o 1 induce il
rilascio di istamina da parte
di basofili sensibilizzati
passivamente con il siero
dei 10 pazienti
Caratterizzazione Rhi o 1 come aspartato proteasi
Nel gel piccole aree non L’attività enzimatica di aspartil proteasi è
colorate compaiono proprio dimostrata dalla sua abilità di catalizzare la
in corrispondenza di 44 kDa degradazione di BSA con un conseguente
(come atteso) incremento di A280 del sovranatante di
reazione
nRhi rRhi
ZIMOGRAFIA IN SOL
(in gel) (con BSA)
Blattella germanica
3 aspartato proteasi sono già state identificate come maggiori allergeni
- Bla g 2 (Blattella germanica) molto studiata a livello molecolare
e strutturale
- Per a 2 (Periplaneta americana)
- Asp f (Aspergillus fumigatus)
Considerevole omologia di
sequenza ma nessuno studio
di cross-reattività in vitro
MSA 4 ASPARTATO PROTEASI ALLERGENICHE
Possibile presenza di
determinanti antigenici
comuni
Cross-reattività tra Rhi o 1 e Bla g 2
IgE ELISA
Test reattività IgE dei 10 sieri
verso rBla g 2
Realizzazione modello 3D
per omologia usando come
templato aspartato proteasi
di lievito (61% identità)
Allineamento delle
coordinate atomiche tra Bla
g 2 e Rhi o 1
Rhi o 1 regione
strutturalmente molto
simile all’epitopo
conformazionale 4C3 di
Struttura bilobata tipica delle aspartato proteasi e Bla g 2
due residui di Asp conservati nel sito catalitico
RISULTATI