TECNOLOGIA ENZIMATICA

ENZIMA
‡ Una enzima es una molécula que se encuentra
conformada principalmente por proteína que
producen las células vivas.

‡ Su función destacada es la de actuar como

catalizador y regulador en los procesos químicos
del organismo.

‡ Las enzima puede catalizar cerca de 4.000

reacciones bioquímicas distintas.

‡ Las actividades de las enzimas están

determinadas por su estructura tridimensional.
ESTRUCTURA
‡ Las enzimas son generalmente proteínas globulares que
pueden presentar tamaños muy variables, desde 62
aminoácidos hasta los 2.500 .
‡ Al igual que las demás proteínas, las enzimas se componen
de una cadena lineal de aminoácidos que se pliegan durante
el proceso de traducción para dar lugar a una estructura
terciaria tridimensional de la enzima, susceptible de
presentar actividad.
‡ Desde el punto de vista químico, las enzimas están formadas
de carbono (C), hidrógeno (H), oxígeno (O), Nitrógeno (Ni), y
Azufre (S) combinados, pero siempre con peso molecular
bastante elevado.
‡ Los sistemas enzimáticos están formados por enzimas, el o
los sustratos, un grupo proteico (o coenzima) y sustancias
activadoras.
NATURALEZA QUIMICA DE LAS ENZIMAS
þ El análisis de las enzimas obtenidas en forma más pura,
cristalizada, demuestra que son proteínas.

þ Las enzimas son inactivadas a altas temperaturas y, en

general, la cinética de la desnaturalización térmica de las
enzimas da resultados muy parecidos a los de la
desnaturalización térmica de las proteínas.

þ Las enzimas son activadas en unas zona muy restringida de

pH, y presenta un punto óptimo de pH donde su actividad es
mayor. Las proteínas muestran propiedades parecidas desde
el punto de vista de viscosidad, solubilidad, difusión, etc., que
resulta del todo similares a las propiedades de este tipo que
muestran las enzimas.
þ Todos los agentes que desnaturalizan a las proteínas
también destruyen o inactivan a las enzimas, ya sea el calor,
los ácidos fuertes, o los metales pesados.

þ Los problemas de solubilidad y de precipitación son comunes

a las proteínas y las enzimas; en general, son solubles en
agua o soluciones salinas, insolubles en alcohol, precipitan
con determinadas concentraciones de sales neutras, etc.
ã
ã

‡ Catalizadores Orgánicos: Aceleran la velocidad de las
reacciones bioquímicas.

‡ Energía de Activación: Las enzimas son moléculas que están

para disminuir la energía de activación de las reacciones
necesarias para la supervivencia celular.

‡ Formación de un Complejo Enzima ± Sustrato: Las enzimas

controlan las reacciones bioquímicas ofreciendo un entorno
tridimensional a los reactivos sobre los que actúan.
‡ Especificidad: cada una de las enzimas cataliza una sola
reacción química o en ciertos casos unas pocas reacciones
íntimamente relacionadas, por la similitud molecular de los
sustratos.

REGULACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

‡ Concentración: Si aumenta la concentración de sustrato o de
la enzima, la velocidad de la reacción también crece.
þ            
 !"
þ Desnaturalización: Cuando las proteínas se
desnaturalización pierden su nivel terciario de organización y,
consecuentemente, dejan de funcionar.
* pH
* Temperatura
* Metales Pesados
ORIGEN Y CLASIFICACION DE ENZIMAS
Las enzimas pueden ser obtenidos a partir de tejidos
vegetales y animales. Inclusive de microorganismos.
Ejemplo:
þ Microorganismos: amilasa, proteasa, pectinasa, invertasa,
glucooxidasa, celulasa, hemicelulasa, lipasa.
þ Vegetales: diastasa de malta, papaína, bromelina y ficina.
þ Animales: enzimas pancreáticas, pepsina, renina, catalasa.

#!

þ Provenientes de vegetales: Requiere el crecimiento de una

gran cantidad de material vegetal para la producción de una
cantidad relativamente pequeña de enzimas.
þ Provenientes de animales: Son consideradas como
subproducto de la industria de la carne.

þ Proveniente de microorganismos: Se puede controlar y

aumentar la capacidad productiva en función del mercado.

Lectura recomendada: Producción de Enzimas Industriales y

su Aplicación en el Procesamiento de
Alimentos.
 Las enzimas se clasifican en seis grupos principalmente:

1) Oxidoreductasas: Son las enzimas relacionadas con las

oxidaciones y las reducciones biológicas que intervienen de
modo fundamental en los procesos de respiración y
fermentación.
Ared + B ox Aox + Bred

Tras la acción catalítica quedan modificados en su grado de

oxidación por lo que debe ser transformados antes de
volver a actuar de nuevo.
Ejemplo:
 $
%


2) Transferasas: Estas enzimas catalizan la transferencia de
una parte de la molécula (dadora) a otra (aceptora). Este
grupo de enzimas actúan sobre procesos de
interconversion de azucares, de aminoacidos, etc.

A-X + B A + B-X

Ejemplo:
Y
Y
Y
V) Hidrolasas: Verifican reacciones de hidrólisis con la
consiguiente obtención de monómeros a partir de
polímeros. Suele ser de tipo digestivo, por lo que
normalmente actúan en primer lugar

A-B + H2O A-OH + H-B

Ejemplo:

›

ã

&#
4) Liasas: Realizan la degradación o síntesis de los enlaces
denominados fuertes sin ir acoplados a sustancias de alto
valor energético.
Catalizan las reacciones reversibles de adición de un grupo
a un doble enlace.

A=B+X AXB

Ejemplo:

%
5) Isomerasas: Actúan sobre determinadas moléculas
obteniendo de ellas sus isómeros de función o de posición.
Es decir, de idéntica formula empírica pero con distinto
desarrollo.

Ejemplo:
  !'


6) Ligasas: Realizan la degradación o síntesis de los enlaces
fuertes mediante el acoplamiento a sustancias ricas en
energía como los nucleótidos del ATP.

A + B + ATP A-B + ADP + Pi

Ejemplo:
%
ã
CINETICA ENZIMATICA
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones
catalizadas por enzimas.

Estos estudios proporcionan información directa acerca del

mecanismo de la reacción catalítica y de la especifidad del
enzima.

La velocidad de una reacción catalizada por un enzima

puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos
casos no es necesario purificar o aislar el enzima.

En 1920 L. Michaelis y M. Menten, estudiaron la cinética de

las reacciones enzimáticas que sólo actuaban sobre un
sustrato.
Determinándose la ecuación básica de la cinética enzimática:
[Eo][S]Kcat
V = -----------------
KM + [ES]
donde:
Kcat [Eo] = Vmax V = ½ Vmax = KM

cuando:
[S] < KM

V = (Kcat/KM)[Eo][S]

En 191V Michaelis y Menten propusieron el siguiente

esquema:
Ks Kcat

E + S ES E + P
Obteniéndose la siguiente ecuación:

[E][S]
KS = --------- y V = Kcat [ES]
[ES]

La concentración total de enzima [Eo] y la enzima libre [E],

están relacionadas por:

[E] = [Eo] - [ES]

Así [Eo] [S] [Eo][S] Kcat

[ES] = ----------- y V = ----------------
KS + [S] KS + [S]
Se presupone que el complejo enzima ± sustrato se
encuentra en equilibrio termodinámico con la enzima libre y
el sustrato. Esto es solo cierto si, K2 < K-1
K1 K2

E + S ES EP
K-1

donde KM > KS se tiene

[Eo][S]
[ES] = -------------------------- y como V = K2 [ES]
[S] + (K2 + K-1)/K1

[Eo][S]K2
V = --------------------------
[S] + (K2 + K-1)/K1
 K2 [Eo][S]
V = --------------
KM + [S]

Vmax [S]
V = --------------

KM + [S]

Ahora KM = (K2 + K-1)/K1

KS para la disociación de [ES] es igual a K-1/K1
KM = KS + K2/K1
y cuando K-1 > K2, la ecuación se simplifica a
KM = KS
X



 

ENZIMAS SUSTRATO KM (mM)

Catalasa H2O2 25.0

Hexoquinasa ATP 0.4
D ± glucosa 0.05
D ± fluctosa 1.5
Anhidrasa carbonica HCOV- 9.0
Quimotripsina gliciltirosinilglicina 108.0
N ± Benzoiltirosinamida 2.5
ß ± Galactosidasa D ± lactosa 4.0
Treonina deshidrogenasa L ± treonina 5.0
Ejercicio
Las velocidades iniciales a varias [S], para una reacción catalizadora.
[S] (moles/litro) V (ȝmoles/min)
5 x 10-2 0.25
5 x 10-V 0.25
5 x 10-4 0.25
5 x 10-5 0.20
5 x 10-6 0.071
5 x 10-7 0.0096
a) Cual es la velocidad máxima para la reacción.
b) Cual es el KM.
c) Calcular la velocidad inicial para [S] = 1x10-6 y [S] = 1x10-1
d) Calcular la [P] formado en los 5 primeros minutos de reacción
utilizando 10 ml. de una disolución de sustrato 2x10-V M.
INHIBIDORES
Son moléculas que se unen a enzimas y disminuyen su
actividad.

La unión de un inhibidor puede detener al sustrato de entrar al

sitio activo de la enzima y obstaculizar que la enzima catalice su
reacción.

La unión del inhibidor puede ser reversible o irreversible.

Los inhibidores irreversibles usualmente reaccionan con la
enzima y cambian su estructura química. Estos inhibidores
modifican los residuos esenciales de los aminoácidos
necesitados para la actividad enzimática.

Los inhibidores reversibles se unen a la enzima de forma no

covalente y diferentes tipos de inhibiciones son producidas
dependiendo en si el inhibidor se une a la enzima, al complejo
enzima-sustrato o a los dos.
Inhibidores Reversibles

Existen tres tipos de inhibidores reversibles:

þ   
El sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la misma
enzima al mismo tiempo"
Esto generalmente ocurre cuando el inhibidor tiene afinidad
por el sitio activo de una enzima donde el sustrato también
se une.
Este tipo de inhibición se puede superar con concentraciones
suficientemente altas del substrato.
Los inhibidores competitivos son a menudo similares en
estructura al substrato verdadero
Resolviendo la ecuación:
[Eo] = [ES] + [EI] + [E]

Se obtiene:

[Eo][S] Kcat
V = ---------------------------
[S] + KM (1 + [I]/KI)
‡  


La unión del inhibidor con la enzima reduce su actividad pero
no afecta la unión con el sustrato. Como resultado, el grado
de la inhibición depende solamente de la concentración del
inhibidor.
donde:
KM de EIS es la misma que de ES
KM = K´M
y EIS no reacciona cuando K´= 0

Kcat/(1+ [I]/KI)
V = -------------------
[S] + KM

KM no es afectada, pero Kcat disminuye según el factor

(1+ [I]/KI)
‡  



La unión del inhibidor afecta la unión del sustrato y viceversa.
Este tipo de inhibición se puede reducir, pero no superar al
aumentar las concentraciones del sustrato.
Se enlazan a un sitio distinto del sitio activo.

Se produce cuando I se fija a ES pero no a E.

Inhibidores Irreversibles

Los inhibidores irreversibles usualmente modifican una

enzima covalentemente, y por lo tanto la inhibición no puede
ser invertida.

Los inhibidores irreversibles son generalmente específicos

para un tipo de enzima y no inactivan a todas las proteínas.
Ejercicio:

Los siguientes datos cinéticos fueron hallados para una reacción de una
enzima.
Evento [S]M V0 µmol/min
1 1.0 x 10-5 15.6
2 5.0 x 10-5 V4.6
V 1.0 x 10-4 41.0
4 5.0 x 10-4 47.0
5 6.0 x 10-2 47.9
6 5.0 x 10-1 50.0
7 8.0 x 10-1 50.0

Determine
(a)Vmax
(b) Km de este sistema.
(c) Cuando se añade un inhibidor competitivo [ I ] = 1.4 x 10-4.
Cuando el sistema tiene [ S ] = 1.0 x 10 -4 , una disminución de un
V0 % de la velocidad. Encuentre [ S ] y el KI de este inhibidor.
Nota: Km ' = Km (1+ [ I ]/KI ).
VENTAJAS DE LA UTILIZACION DE ENZIMAS

þ Son sustancias naturales.

þ No son tóxicos.
þ Cataliza determinada reacción sin provocar reacciones
secundarias indeseables.
þ Son activos en condiciones muy moderadas de Tº y pH.
þ Son especificas.
þ Son biodegradables.
þ Es posible controlar la velocidad de reacción ajustando la Tº,
el pH y la cantidad de enzimas utilizadas
þ Se inactivan fácilmente cuando se considera que han
cumplido su objetivo.
DESVENTAJAS DE LA UTILIZACION DE ENZIMAS

þ La necesidad de purificación para eliminar sitios activos no

deseados.
þ Velocidades de reacción menores que las deseadas.
þ Estabilidad pobre a largo plazo.
þ Desactivación por ciertos metales.
þ Funcionalidad sobre un reducido rango de pH, resistencia
iónica y temperatura.
APLICACIONES DE ENZIMAS EN ALIMENTOS

p
  p

    


      


    

       
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 Las aplicaciones industriales se refieren a la producción de
una transformación útil por alguna enzima, bien sea natural o
añadida intencionalmente.

‡ '
La fermentación alcohólica es un ejemplo conocido de los
procedimientos en que se efectúan alteraciones enzimáticas,
tanto cuando se agrega alguna enzima como cuando se
añade algún microbio vivo (levadura).
Se calienta el grano amiláceo para gelatinizar el almidón. Se
añade malta (que contienen enzimas diastásicas) para
convertir el almidón en azúcar fermentable (maltosa). Adición
de levaduras para la formación de alcohol.

La elaboración de vinagre con alcoholes es un proceso

enzimatico producido por un microorganismo (Acetobacter
aceti). Como el alcohol es oxidado y convertido en ácido
acético con oxígeno de la atmósfera. Aislada de las
bacterias, la enzima cataliza igualmente la oxidación, pero es
mucho más económico valerse de los microorganismos.
‡ '   
La coagulación de la leche es el proceso más importante. La
caseína se coagular mediante la adición de ácido o de
enzimas (rennina).

La rennina produce un coágulo elástico del que se exprime

fácilmente el suero.

También se utilizan mezclas de rennina con pepsina. Como

también papaína, y en este caso al parecer se asegura la
proteólisis durante el añejamiento del queso.

Se emplea jugo de higos ( que contiene gran proporción de

enzimas proteolíticas ficina). Para preparar el coágulo.

La diferentes enzimas coagulantes hacen variar

notablemente la naturaleza del queso.
‡ !

"
Las enzimas que se hallan en la harina. La harina cruda
contiene cantidad relativamente pequeña de muchas
enzimas, que ayudan a reblandece la masa.
La harina de trigo contiene también pequeñas cantidad de
p-amilasa y gran proporción de -amilasa.
La adición de la p-amilasa a la harina, generalmente en
forma de harina de trigo malteado, ocasiona aumento de
volumen de la hogaza.
La amilasa agregada hidroliza parte del almidón y lo
convierte en maltosa, con lo cual suministra mas azúcar para
que fermente la levadura y origina la generación de mayor
cantidad de dióxido de carbono.
La -amilasa que ya existe en la harina coopera
probablemente en el proceso mediante la desintegración de
las dextrinas formadas por la p-amilasa.
þ '

# 
A veces la pulpa de las frutas hace que los zumos sean
turbios y demasiado viscosos, produciéndose también
ocasionalmente problemas en la extracción y en su eventual
concentración. Esto es debido a la presencia de pectinas
que pueden destruirse por la acción de enzimas presentes en
el propio zumo o bien por enzimas añadidas obtenidas de
fuentes externas.

þ '  $!  % &    ! '#

Estos jarabes se utilizan en la elaboración de bebidas
refrescantes, conservas de frutas, repostería, etc. en lugar
del azúcar de caña o de remolacha. Las enzimas utilizados
son las alfa-amilasas y las amiloglucosidasas. La glucosa
formada puede transformarse luego en fructosa, otro azúcar
más dulce, utilizando el enzima glucosa-someraza,
usualmente inmovilizado en un soporte sólido.
þ &  #(
La extracción de la sacarosa, a partir de la melaza de la
remolacha azucarera puede complicarse por la presencia de
rafinosa, un trisacárido que previene la cristalización.
Para incrementar la recuperación del azúcar y mejorar el
proceso, la rafinosa puede degradarse enzimáticamente. El
resultado de esta degradación es doble; por un lado favorece
la cristalización y, además, produce sacarosa como uno de
los productos de la hidrólisis. La enzima que se utiliza es
la p-galactosida.
Se realiza un tratamiento similar en el proceso de obtención
a partir de la caña de azúcar, donde el almidón es hidrolizado
antes de la cristalización mediante el uso de p-amilasa.
‡   
El proceso tradicional involucra el uso de solventes
orgánicos.
El empleo de enzimas celulolíticas y pectinolíticas hace
posible la ruptura de las paredes celulares y la liberación del
óleo contenido en ellas. Aumentando los rendimientos de
extracción, se disminuye la oxidación y pueden eliminarse los
solventes orgánicos.
Las lipasas y fosfolipasas se utilizan en el desgomado de
aceites durante su refinamiento. El uso de lipasas modifica
las propiedades funcionales de grasas y aceites, tales como
la temperatura de fusión y solidificación, para obtener una
grasa con las características deseadas.
‡ 
%
!
& !

Las proteasas y pectinasas también se utilizan para obtener

proteínas y pectinas modificadas, usadas como:

- sustitutos de grasas,
- emulsificantes,
- espumantes,
- texturizantes,
- gelantes y
- modificadores de viscosidad.
‡   !

Para evitar la contaminación microbiana en alimentos donde la

pasteurización no es el método más convenientes se utiliza
peróxido.
La enzima catalasa, que degrada el peróxido en oxígeno y
agua, cumple con esta función. Otra aplicación factible de la
catalasa, en combinación con la glucosa-oxidasa, es que agota
el oxígeno presente en bebidas embotelladas y alimentos
empacados y evita así su oxidación y descomposición.
La glucosa-oxidasa elimina el exceso de glucosa cuando ésta
es indeseable, porque interviene en reacciones de Maillard y
caramelización. Tal es el caso de la preparación de huevo en
polvo.
Las lisozimas degradan la pared celular de algunas bacterias y
son una alternativa al uso de nitratos para la conservación de
alimentos. Está disponible comercialmente y es extraída de la
clara de huevo.
þ m
!

Los enzimas se utilizan en la industria alimentaría de muchas
otras formas, en aplicaciones menos importantes que las
citadas anteriormente. Por ejemplo,
La fabricación de productos derivados de huevos, las trazas
de glucosa presentes, que podrían oscurecerlos, se eliminan
con la acción combinada de dos enzimas, la glucosa-oxidasa
y la catalasa.
La papaína y bromelína, enzimas que rompen las proteínas,
se pueden utilizar, fundamentalmente durante el cocinado
doméstico, para ablandar la carne.
La lactoperoxidasa, podrían utilizarse en la conservación de
productos lácteos.
ENZIMAS INMOVILIZADAS
Se entiende por enzima inmovilizada (EI) aquella que física y
químicamente esta asociada o contenida en un soporte
matriz no esencial para su actividad.

La inmovilización permite la utilización de las enzimas en

procesos continuos, lo que permite aumentar su
productividad, ó bien para facilitar la separación del
catalizador de sus productos, simplificando la etapa posterior
de purificación.
 ])
!
!

#
!#
‡ El aumento de la estabilidad de la enzima.
‡ La posible reutilización del derivado, por lo que disminuyen
los costes del proceso.
‡ La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil
manejo y control, adaptado a la aplicación de la enzima
inmovilizada.
‡ Desarrollo de sistemas continuos.
‡ Uso eficiente del catalizador.
‡ Efluentes libres de catalizadores.
)
!


!#

‡ La alteración de la conformación de la enzima respecto de su
estado nativo.
‡ Siempre suele haber una pérdida de actividad de la enzima
durante la movilización.
‡ El biocatalizador es más caro que la enzima nativa.
‡ Costo adicional del soporte, reactivos y operaciones de
inmovilización.
‡ Poco adecuado a sustratos insolubles o elevado peso
molecular.
‡ Mayor riesgo de contaminación en operaciones continuas de
reactores.
METODOS DE INMOVILIZACION
Suelen clasificar en dos grandes categorías:
þ 
 

2
22 

Consiste en la retención física de la enzima en las cavidades

interiores de una matriz sólida porosa.  atrapamiento puede
ser en geles o en fibras. Como ventaja la enzima no sufre
ninguna alteración en su estructura.
K
  

K2 2
2





 Microencapsulación: Las enzimas están rodeadas de
membranas semipermeables que permiten el paso de
moléculas de sustrato y producto, pero no de enzima.
Mediante este método se pueden encapsular
simultáneamente una gran variedad de enzimas, células o
biomoléculas.
Ejemplo de enzimas inmovilizadas
 Los métodos de inmovilización se pueden dividir en:

* 
Es método simple de inmovilización, en el que el soporte es
mezclado con las enzimas, en condiciones apropiadas de
pH y fuerza iónica, dejados en contacto por un determinado
periodo y después lavado para remover la proteína no
adsorbida.
Este método permite valores elevados de carga enzimática
(hasta 1 gramo de enzima por gramo de soporte).
 La selección del soporte pasa por su capacidad de retener la
enzima, sin dejar de sorber nuevamente al seno del liquido,
actividad enzimática obtenida, posibilidad de regeneración y
costo.
Como ejemplos de soporte tenemos materias orgánicas
neutras (carbón activo y celulosa) y cargadas ( ,
intercambiadores aniónicos y catiónicos), además de materia
inorgánica (bentonita, alúmina, vidrio y sílica porosa).

* ! !

La unión covalente se produce entre grupos funcionales del
soporte y determinados grupos en los residuos
aminoacídicos de la molécula enzimática.
Ejemplo de químicos son la carbodiimida y el glutaraldeído.

Este ultimo es ampliamente utilizado para, además de

inmovilizar enzimas a soportes, hacer el entrecruzamiento
entre las enzimas ó mezcladas con otras proteínas inertes,
hasta se producir agregados insolubles de tamaño
considerable.

Se puede combinar la adsorción con la formación de enlaces

covalente, con lo que se obtiene un aumento sustancial de la
estabilidad del catalizador
* ! 


En este método, la enzima es contenida entre las cadenas de
una red polimérica, lo suficientemente compacta para retener
la enzima, pero capaz de permitir el libre flujo de reactantes.

Esto tiene la implicación que solo es útil este tipo de

inmovilización cuando se pretende procesar sustratos y
productos de muy bajo peso molecular.
Este método es más adecuado para inmovilizar células,
donde el alginato de calcio es ampliamente utilizado.

Ejemplos de matrices son los geles de poliacrilamida y el

almidón.
Estos presentan las desventajas de no ser regenerables,
una baja estabilidad, tener pobres propiedades mecánicas y
severas restricciones difusionales.
*   
En este tipo de sistemas la enzimas permanece libre el
solución, separada del medio de reacción por una membrana
protectora que solo permite el libre paso de los reactantes
(sustrato/producto).

Ejemplo, tenemos las membranas de ultrafiltración y diálisis.

Otro método consiste en la microencapsulación, en la cual se

produce una reacción de polimerización en la superficie de
las gotas de solución enzimática, dispersas en un solvente
inmiscibles con agua, que produce una delgada película
(nylon), casi sin restricciones difusionales.
PARAMETROS DE INMOVILIZACION
Hay dos parámetros a considerar en la inmovilización: el
rendimiento de inmovilización y la capacidad de carga del
soporte.
El rendimiento de inmovilización (RI) es dada por:

Algunos autores usan:

La capacidad de carga (CC) del soporte se define como la
actividad cargada expresada en el catalizador (EI) por unidad
de peso seco del soporte (W), lo que viene dada por:

Ambos los parámetros, EI y CC, están frecuentemente en

compromiso, es decir, para aumentar la CC se tiene que
sacrificar el EI y viceversa.