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V Recentemente la scoperta di DNA libero nel plasma


e nel siero umano ha aperto un nuovo campo di
indagine e ricerca in ambito oncologico e
prenatale;
V Variazioni qualitative e quantitative nei livelli
plasmatici e serici di DNA libero nucleare (ccf
nDNA) e mitocondriale (ccf mtDNA) sono risultate
associate a svariate tipologie tumorali (Wu TL et
al., 2002; Zachariah RR et al., 2008);
V Nelle pazienti affette da cancro al seno:
i livelli plasmatici e serici di ccf nDNA aumentano
rispetto alla condizione di controllo (Zanetti-Dallenbach
R et al., 2007 e 2008);
i livelli plasmatici e serici di ccf mtDNA diminuiscono
rispetto alla condizione di controllo (Wang Y et al.,
2006; Mambo E et al., 2005).
 

V Valutare l·andamento simultaneo dei livelli di


ccf nDNA e ccf mtDNA nelle pazienti sane e
in quelle affette da cancro o tumore benigno
del seno.
V Valutare possibili correlazioni dei livelli di ccf
nDNA e ccf mtDNA con i parametri
clinicopatologici nelle pazienti affette da
cancro al seno;
V Indagare il valore diagnostico dei livelli
plasmatici di ccf nDNA e ccf mtDNA nei
confronti del tumore e del cancro al seno;
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V½ 8 donne reclutate presso gli ospedali


dell·università di Basel e Liestal nel periodo
2005-2007 sono state suddivise nei seguenti
gruppi:
Gruppo ½ con tumore maligno (n = 52);
Gruppo 2 con tumore benigno (n = 26);
Gruppo 3 sane di controllo (n =70).
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V Tutti i campioni di sangue (½0 mL) sono stati


prelevati prima di qualsiasi intervento o
trattamento farmacologico;
V I campioni di sangue sono stati centrifugati e
il plasma separato e suddiviso in aliquote da
00 ÿL;
V il DNA plasmatico è stato estratto (in 80 ÿL)
e quantificato secondo un protocollo
standardizzato;
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V a 
  
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D     niversal PCR Master Mix +


D 0.75 —l di ciascun primer ½0 —M (3 —l)+
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V non è stata osservata alcuna differenza


significativa fra i livelli di nDNA e mtDNA in
funzione dei seguenti parametri
clinicopatologici:
Positività linfonodale;
Grado di metastasi;
Livello di espressione dei recettori ER, PR ed
Her2/neu

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V Primo studio che riscontra aumentati livelli di ccf


nDNA e diminuiti livelli di ccf mtDNA in pazienti
affetti da tumore al seno rispetto ai soggetti sani;
V Il test per la stima:
dei livelli di ccf nDNA mostra un probabile valore
diagnostico nel discriminare i pazienti affetti da
tumore maligno rispetto ai soggetti sani con sensibilità
dell·8½ e specificità del 69;
dei livelli di ccf mtDNA mostra un possibile valore
diagnostico nel discriminare i pazienti affetti da
tumore maligno rispetto ai soggetti sani con sensibilità
dell·53 e specificità del 87;
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biomarker di tumore maligno (cancro) al seno?


D i, perché i suoi livelli plasmatici sono risultati
significativamente aumentati nel gruppo ½ rispetto ai gruppi
2 e 3;
è più sensibile e accurato dei seguenti biomarker
plasmatici: nucleosomi, VEGF e sVEGFR½ (eefeld M.
et al., 2008; El Tahouny  et al., 2008).
potrebbe essere utile nella gestione delle pazienti con
cancro al seno poiché i suoi livelli possono cambiare
dopo chemioterapia (Deligezer  et al., 2008);
I suoi livelli sono risultati correlati positivamente alla
dimensione tumorale nelle pazienti con tumore
maligno di piccole e medie dimensioni e quindi
potrebbero essere utili per fare diagnosi precoce di
tumore al seno.
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V biomarker di tumore mammario?


Forse si, poiché i suoi livelli risultano
significativamente diminuiti rispetto alla
condizione di controllo;
V Poiché alcuni studi hanno riportato
aumentati livelli di mtDNA nei soggetti
oncologici rispetto ai soggetti sani
(Mizumachi T. et al., 2008) sono necessari
ulteriori studi per indagare il reale
andamento dei livelli di mtDNA nelle diverse
condizioni patologiche e tipologie tumorali.
V Poiché il valore AC per la curva ROC relativa
ai livelli i ccf mtDNA fra controlli e soggetti
con tumore è pari a 0,69 , il test secondo la
classificazione  ets è poco accurato.
V Forse, per il momento, quindi è un po·
azzardato parlare di biomarker per quanto
riguarda l·mtDNA.
V lteriori studi devono essere fatti per
migliorare la performance analitica e per
valutare l·andamento dei livelli di mtDNA
nelle diverse tipologie tumorali.
Fine
Vè stata condotta una curva di calibrazione
con concentrazioni note scalari di DNA
genomico umano (3½250, 6250, ½250, 250, ½0
pg/ÿL);
V I risultati sono stati espressi in termini di
genomi equivalenti (G.E.)/mL di plasma
usando come fattore di conversione 6,6 pg di
DNA per cellula (½ G.E.) e come fattore di
diluizione 80.
V Ilcontenuto di ccf mtDNA è stato ricavato
indirettamente dal relativo contenuto in ccf
DNA utilizzando il metodo di approssimazione
del 2Ct (2Ct = CtnDNA-CtmtDNA) per cui
n°copie mtDNA = 2^ 2Ct) .
V Per la conversione in GE/mL è stata usata la
seguente formula relativa: mtDNA= (GE/mL )
nDNA * (mtDNA copie/nDNA copie).
VR  
: per valutare se i dati sono
normalmente distribuiti. I dati non sono risultati
distribuiti non normalmente.
V R   
 
    : per
la comparazione dei livelli di nDNA e mtDNA fra i
diversi gruppi di studio;
V R   
 
    e R 

 : per valutare l·associazione tra i
livelli di nDNA e mtDNA e i parametri
clinicopatologici nelle pazienti affette da cancro
al seno;
V P<0.05 livello di significatività accettabile
V La capacità diagnostica (o validità   &, 
('(  ( ( a  di &(  ' (  
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affetti da una determinata malattia e ad una diagnosi
negativa nei soggetti non ammalati.
V Essa può essere valutata attraverso una semplice tabella di
contingenza , confrontando l· ((('( ' & 
a '( ( .  

VP FP
FN VN
V Ilconfronto fra i risultati del test in esame e
l·autentico stato di ogni individuo consente
di stimare due importanti parametri:
V la sensibilità (e) ossia la probabilità che un
animale ammalato risulti test-positivo;
e= VP/(VP+FN)
V la specificità (p) ossia la probabilità che un
animale sano risulti test-negativo
p= VN/(VN+FP)
V CurvaROC: si costruisce riportando in ascissa la
proporzione di falsi positivi ovvero ½-specificità (
½- VN/VN+FP) e in ordinata la corrispondente
proporzione di veri positivi ovvero la sensibilità
(VP/VP+FN).
V Permette di fare una stima del potere
diagnostico di un test mediante il valore
dell·area sottesa tra la curva ROC e l·asse
delle ascisse (valore compreso fra 0.5 e ½).
V Consente la scelta di un cut-off che sia un
buon compromesso fra sensibilità e (½-
specificità) (Youden Index)
V Youden index: è la massima distanza fra la
curva ROC e la diagonale di riferimento (test
non informativo) e consente di risalire al cut
off relativo ai corrispondenti valori di
sensibilità e specificità interpolati sulla cura
ROC dallo Youden index;
V Cut off: valore che consente di discriminare
fra le due popolazioni in studio (sani-malati).
V Classificazione
di  ets per la capacità
discriminante di un test in base ai valori di
AC: