CROMATOGRAFIA LÍQUIDA - INSTRUMENTAÇÃO

Antes 1965 - Colunas de vidro

Partículas > 100 m
Fase Normal (silica, alumina, etc.)
Amostras pouco polares
Fluxo induzido por gravidade
Tempo: horas - dias
Detecção: off-line (UV, pH, gravimetria, etc)
1965 a 1970 - Partículas 30-50 m
Bombas para impulsionar FM
Primeiros detetores on-line: IR, UV.
Depois 1975 - Fase Reversa (C18, C8, C2, etc.)
Compatibilidade com amostra biológicas polares
Tempo: minutos
Depois 1980- Automação completa
CROMATOGRAFO LÍQUIDO
SOLVENTES

BOMBA DETETOR COLETOR

INJETOR COLUNA
DESCARTE
SOLVENTES

Número de canais:
Sistema isocrático - um canal de solvente

Sistema gradiente - Binário - dois canais

Ternário - três canais
Quaternário - quatro canais

Modos de desaeração dos solventes:

Vácuo + ultrassom
Hélio (He)
Membrana
Mecânico
 BOMBAS

Função
Proporcionar fluxo contante e continuo de FM a todo o sistema.

Componentes
Bomba (pistões)
Câmara de mistura de solventes
Amortecedor de pulsos
 BOMBAS

Características desejáveis
Resistência a solventes (aço, titânio, peek, teflon)
Fornecer reprodutibilidade e precisão na composição da FM
Fornecer fluxos precisos e exatos (+ 0,1%)
Analítica: 0,01 a 10,0 mL/min
Preparativa: 0,1 a 20,0 mL/min (pelo menos)
Fluxos sem pulsação
Resposta rápida á mudança de fluxo e composição da FM
Manutenção fácil
Modular

Tipos de bombas
Pressão constante
Fluxo constante
 BOMBAS

Importância na precisão do fluxo da FM

•Análise Qualitativa
Variação no fluxo resulta em variação no tempo de retenção,
levando a erro na localização de componentes da amostra,
principalmente em misturas complexas.

•Análise Quantitativa
Os detetores mais comumente utilizados são sensíveis à
concentração dos analitos. Alterações no fluxo afetam o
tempo de passagem de uma banda pela cela do detetor,
causando alterações na área do pico e, consequentemente, na
quantificação.
 BOMBAS - Pressão constante

Vantagens
• Simplicidade
• Ausência de pulsação
• Baratas
• Operação e manutenção fáceis

Desvantagens
• Monitoramento do fluxo deve ser cuidadoso e constante,
especialmente em analises quali e quantitativas
• Fluxo pode variar com mudanças de temperatura e
viscosidade
 BOMBAS - Fluxo constante

Vantagens
• Alta reprodutibilidade do volume de eluição e da área do
pico, independentemente de viscosidade da FM ou
bloqueio da coluna, até um limite de pressão.

Dois tipos:
• Deslocamento positivo (Seringa)
Sem qualquer pulsação no fluxo ou pressão
Ideal para Micro-HPLC (fluxos de l/min)
Precisa ser recarregada após terminar o volume da seringa

• Reciprocante
Pode manter fluxo por tempo indefinido
Precisa amortecer de pulsos
 BOMBAS RECIPROCANTES
Controle do fluxo
Variando o caminho do pistão
Variando a velocidade de rotação
Problema
Pulsos sinoidais

Reciprocante de duas cabeças

Pulsos atenuados
Sistema mais popular

Cuidados especiais
Limpeza das “check valves”
Partículas FM e amostra
Custo de manutenção
 BOMBAS RECIPROCANTES
Avanços mais recentes

A computer-designed camshaft is used to achieve maximum overlap o

resulting in virtually undetectable pulsation or ripple.
Staggered inlet/outlet lines are employed to allow complete flushing w
changed or if air is inadvertently drawn through the pump.
Small-volume check valves are used to allow the pumps to function r
low as 0.001 mL/min. This has the added benefit of providing excelle
reproducibility especially when programs start from extremely low co
There are fewer moving parts, with all maintenance-requiring compon
check valves) readily accessible from the front of the instrument.
A wide flow rate range (0.01 to 10 ml/min) is provided without gear c
 Amortecedores de Pulso - (Pulse Damper)

Controla pressão de gases e líquidos

Reduz pulsos para < 0,1 %
Pressão externa pode ser monitorada e controlada pelo sistema
Sistema mais caro, mas mais eficiente e mais utilizado.
INJETOR

Manual
Automático

Precisão
 PRÉ-COLUNA
PRÉ- (guard column)

Instalada entre o injetor e a coluna, com cerca de 2 cm de

compr., tem a função de:
1. Remover partículas;
2. Remover substâncias que teriam forte interação com a
coluna;
3. Remover substâncias que possam precipitar quando
em contato com FM e FE.
4. Resumindo, aumentar o tempo de vida das colunas.

As pré-coluna devem ser substituidas regularmente.

 CUIDADOS COM A COLUNA - CLAE
1. Manter a coluna sempre tampada
2. Evitar choques de pressão, térmicos e mecânicos
3. Usar pré-coluna (guard column)
4. Usar solventes ultrafiltrados
5. Pré-tratamento das amostras deve considerar eliminação de
partículas e de impurezas que possam ficar adsorvidas
6. Obedecer faixa de pH em que a FE é estável (2 < pH <8)
7. Eliminar sais, tampões e aditivos de FM antes de armazenar
coluna
8. Fazer diagnóstico periódico (N, Simetria e k´)

Limpeza
Sílica: HexanosDCM AcOEt DCM Hexanos (20 Vm de cada)
Fase reversa: MeOH ou ACN 100% DCM  MeOH ou ACN 100%
Fluxo: 1 a 2 mL/min
 DETETOR - Tipos
Em relação à forma de resposta:
resposta
• Detetor diferencial
Mede a diferença instantânea na composição do eluente
• Detetor Integral
Mede a quantidade acumulada de componentes da amostra que atingem o detetor
Em relação ao tipo de resposta:
• Detetor sensível à concentração
A resposta é proporcional à quantidade de analito no eluente
• Detetor sensível ao fluxo de massa
A resposta é proporcional à quantidade de analito que atinge o detetor, por
unidade de tempo
Em relação à seletividade:
• Detetor Universal
Responde a qualquer analito que elua do sistema, exceto à FM
• Detetor Seletivo
Responde a grupos relacionados de analitos
• Detetor Específico
Responde a um componente específico da amostra, ou a um número limitado de
componentes que possuem características químicas similares
 DETETOR

Duas classes:

 Monitoram propriedades do eluente (FM + Analito)

 Monitoram propriedades especifica do analito

Características de um bom detetor

Alta sensibilidade
Baixo limite de detecção
Linearidade
Reprodutibilidade
DETETOR

Emite um sinal quando analito sai (elui) da coluna.

Esse sinal é transformado em um pico no cromatograma.

Principais tipos de detetores:

Ultra-violeta/visível (UV/VIS)
Índice de Refração (IR)
Fluorescência
Eletroquímico (DEQ)
Radioquímico
Espectrômetro de Massas (EM)
Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
Espalhamento de luz (LS)
 DETETOR

Ruído e deriva

• Ruído (N): Incerteza no valor da linha de base, sem o analito.

Alta freqüência (> 1Hz):
1Hz) ruído eletrônico do detetor, intregrador e/ou da
pulsação do sistema de bombeamento;
Baixa freqüência (<0,1 Hz):
Hz) Interferência externa ou sistema com
problemas: FM mal misturada
Variação na temperatura
Sangria da FE
Analitos de amostras anteriores com eluição tardia
Lâmpada ruim (velha)
•Deriva:
Inclinação média da linha de base, em Volts, Amperes ou Uabs por hora
 DETETOR

Linearidade e Sensibilidade

•Resposta linear: Quando a intensidade do sinal é proporcional à

concentração do analito.
•Limite de detecção: Quantidade mínima do analito que pode ser detectada
(diferenciada do ruído). Isto é, pelo menos 2x a altura média do ruído.
•Limite de Quantificação inferior: Quantidade que pode ser quantificada com
segurança, com um nível especificado de exatidão e precisão. Usualmente,
altura do sinal do analito 5 a 10x maior que o sinal o ruído médio.
•Limite de Quantificação superior: Maior quantidade de analito para a qual o
detetor ainda responde linearmente.
 DETETOR -Índice de Refração
Sensível ao desvio da luz provocado pela passagem de um
meio para outro, com índices de refração diferentes.
Detecção ocorre quando a luz é desviada em função da
passagem de moléculas de analito pela cela do detetor,
mudando o Indice de refração da FM.
Usa cela de referência com FM
Universal
Opera apenas no modo de eluição ISOCRÁTICO
Opera com qualquer solvente
Aplicação: Substâncias sem cromóforos
(aminas alifáticas, açúcares, álcoois alifáticos)
Muito sensível a variações de temperatura (+ 0,0001o C)
DETETOR -Índice de Refração
DETETOR -UV/VIS

Ultra violeta: 190 - 400 nm

Visível: 400 - 800 nm

Mais usado: 70% das aplicações

Três tipos:
Comprimento de onda fixo
Comprimento de onda variável
Comprimento de onda múltiplo
Detetor com Arranjo de Diodos - DAD
DETETOR -UV/VIS
A: absorbância
I0: luz incidente
I: luz transmitida
: absortividade molar
b: compr. Do caminho ótico (cm)
c: concentração molar

Leitura: unidades de absorbância (ua)

1 ua = depreciação da luz incidente em 90%
: depende do comprimento de onda () e das condições
cromatográficas (solvente, pH e temperatura)

max = > > sensibilidade

 DETETOR -UV/VIS
A: absorbância
I0: luz incidente
I: luz transmitida
: absortividade molar
b: compr. Do caminho ótico (cm)
c: concentração molar

Criptomoscatona D2
mAU

OH OH
215 nm 223 nm 252 nm 280 nm
500

O O

300

100

250 300 350

nm

max = > > sensibilidade

DETETOR - UV/VIS

fixo
 DETETOR - FLUORESCÊNCIA
 Detetor mais sensível disponível
para LC Detetores FLU - três tipos:
 Filtros
 10-1000x mais sensível que UV para
 Monocromador p/ emissão
substâncias com fluorescência
 Monocromador p/ excitação
intensa
 Cerca de 15% das substâncias e p/ emissão
orgânicas possuem fluorescência
 Muito específico e seletivo
Cela de
Fluxo

Elétrons conjugados
Anéis aromáticos***
Monocromadores

Lâmpada
de Xenônio
 DETETOR - FLUORESCÊNCIA

Elétrons conjugados Substâncias não fluorescentes

Anéis aromáticos***
DERIVADOS
DETETOR - ELETROQUÍMICO
 Seletividade e sensibilidade para substâncias que possam ser
facilmente oxidadas ou reduzídas.
 Mede a corrente gerada na oxidação/redução de analitos, num
eletrodo adequado.
 Requer FM condutora, com eletrólitos e ajuste de pH.
 Presença de O2, contaminação por metais ou haletos na FM
causam corrente de fundo e, assim, ruído e deriva na linha de
base.
 Sensibilidade a fenóis, nitrosaminas, catecolaminas, ácidos
orgânicos: nanogramas. Eletrodo de trabalho (ET)
(ER) Eletrodo de referência

 Aplicação: monitoramento dessas

substâncias em matrizes
complexas: fluídos corpóreos,
produtos naturais, etc.

Contra-eletrodo
 Condições
Condições para
para uma
uma reação
reação eletroquímica
eletroquímica

 Reação
Reação do
do analito
analito no
no superfície
superfície do
do ET
ET éé monitorado
monitorado
através
através do
do tempo
tempo (t)
(t)
 O
O composto
composto deve
deve ser
ser eletroquimicamente
eletroquimicamente ativo.ativo.
 O
O potencial
potencial estabelecido
estabelecido entre
entre oo ET
ET ee oo ER
ER
determinará
determinará aa reatividade
reatividade dodo analito
analito

Reação
Reação eletroquímica
eletroquímica para
para dióis
dióis aromáticos
aromáticos geminais
geminais

HO
HO O
O
++ 2H ++
+
2H + 2e 2e--
HO
HO O
O
 DETETOR - ELETROQUÍMICO

Tipos
Tipos de
de eletrodo
eletrodo
Material
Materialdo
doET
ET Limites
Limitesde
dePotencial
Potencial(V)
(V) Aplicações
Aplicações
Alcalino
Alcalino Ácido
Ácido

Carbono
Carbono -1,50
-1,50 +0,60
+0,60 -0,80
-0,80 +1,30
+1,30 Catecolaminas
Catecolaminas
Ouro
Ouro -1,25
-1,25 +0,75
+0,75 -0,35
-0,35 +1,10
+1,10 Carboidratos
Carboidratos
Platina
Platina -0,90
-0,90 +0,65
+0,65 -0,20
-0,20 +1,30
+1,30 Álcoois,
Álcoois,glicóis
glicóis
Prata
Prata -1,20
-1,20 +0,10
+0,10 -0,50
-0,50 +0,40
+0,40 Haletos,cianetos
Haletos,cianetos
Cobre
Cobre ---
--- +0,60
+0,60 ---- ---
--- Aminoácidos
Aminoácidos

Riber, J.;... Sánchez-Batanero, P. Talanta. 2000, 52, 241.

DETETOR - ESPALHAMENTO DE
LUZ EVAPORATIVO
Coluna
 O eluente, ao sair da coluna, é misturado
com um gás nebulizador (N2) para
formar um aerosol: dispersão uniforme Nebulizador
de gotas. Despressurizador

 A FM é vaporizada no tubo de deriva, Gás N2

restando gotículas de analitos. Tubo de deriva
Nebulizador

 As gotículas espalham a luz do laser. aquecido

 Esse espalhamento é medido pelo

fotomultiplicador, colocado a 90o do feixe Gotículas
de a mostra
laser.
 Outro sensor é colocado em frente (180o)
do feixe laser, e mede qualquer luz não
desviada.
Amplificador
Fonte de Luz
Laser

Exaustor

Fotodetector
Aplicabilidade de detetores em Produtos Naturais
DETETOR SEL. (S) SENSIB. AN. QUALIT. AN. QUANT. PREP. BIOSSÍNT. GRADIENTE
UNIV. (U)
IR U + + + -
Uvfixo S + + + +
UVvariável S ++ ++ + +
UV - DAD S ++ + ++ +
FLUOR S +++ ++ +
EM U +++ ++ ++ + +
RMN 1H U ++ ++ + +
RADIOQUÍ S ++ + +
MICO
ELETROQUÍ S ++++ ++
MICO
LS U ++ ++
IV U ++ ++ ++
HIGH THROUGHPUT SCREENING (HTS)

INJETOR
AUTOMÁTICO Bioreator

SOLVENTES
DETETOR 1 DETETOR 2
+ UV
BOMBA

COLUNA

DESCARTE
+ EM