Resolução cromatográfica:

N (  1) k '2
Rs  . .
4  (k '2 1)

EFICIÊNCIA
Depende da
configuração
do sistema
FATORES FÍSICOS

SELETIVIDADE RETENÇÃO
Dependem das características
da FM e FE do sistema
FATORES QUÍMICOS
Resolução cromatográfica FINALIDADE
ANALÍTICA

(SELETIVIDADE)

TEMPO

N (  1) k '2
Rs  . . Rs
4  (k '2 1)

(RETENÇÃO)
N
(EFICIÊNCIA)

1,0
3,5 1,0

3,0 Rs  N 0,8
0,8
Influência na Resolução

0,6

k'
2,5 0,6

K'/(1+K')
Rs 
( - 1 )

2,0 0,4
 1 0,4

k '1
Rs 

1,5 0,2 0,2

1,0 0,0 0,0

0 2 4 6 8 10 12 14
0 2 4 6 8 10 K'
0 2 4 6 8 10
nN 
Otimizando retenção (k’)
e seletividade ()

Controlar (ou ajustar) interações

entre analitos, FE e FM. Fase Normal (NP)

1. Selecionar modo cromatográfico

Fase Reversa (RP)

2. Otimizar composição da FM - ajuste fino.

3. Reavaliar seleção da FE
4. Redimensionar FE (L, di e partículas)
Fase Normal (NP)
Interações FE x analito e FE x FM
• Ponte de hidrogênio
• Dipolo - dipolo
• Dipolo - dipolo induzido
Influência do teor de água na FM sobre a
eficiência (H) e retenção (k’).
FE: Sílica FM: DCM Amostra: Fenilpropanol
H Ex: Sílica gel
H
O
O
H
HO OH H Desvantagens:
OH HO
Si O O
OH
H3Si
O Si O
Si
CH3
Si • Difícil controle da
H3C Si O H3C

H3C
atividade de água
H3C CH3

• Forte adsorção de
substâncias polares
Preparação de FM com
50% de água de saturação
1.1.Preparar
PrepararFM
FMseca
seca 2.2.Preparar
PrepararFM
FMsat.
sat.
Ativar Si a 140o C (4 h) 25 g Si (70-230 mesh)
Adicionar solvente 5 mL de água c/ agitação
Agitar - Decantar - Filtrar + 5 g de Si

Solvente Anidro Si sat. Água

FM seca  100 mL de FM seca

1:1
1:1 FM sat. água
 2 g Si sat. c/ água
 Agitar 30 min.
 Decantar - Filtrar

FM 50% SAT. C/ ÁGUA

Cromatografia em Fase Normal
VANTAGENS DESVANTAGENS

1. Permite grandes variações na seletividade através 1. Amostras iônicas são mais facilmente separadas
da variação da composição da FM por RPC.
.
2. Colunas são muito estáveis em FM não aquosa 2. Controle da força de eluição da FM é mais difícil
do que em RPC
.
3. Muitas substâncias orgânicas são mais solúveis 3. Menor p. e. dos solventes usados na FM causam
nos solventes de NPC (vantagem em Crom. Prep.) formação de bolhas.

4. Pressão necessária é menor devido menor 4. Retenção pode variar em função de água
viscosidade dos solventes. adsorvida pela FE.

5. Útil para análise de amostras que podem 5. Eluição em gradiente limitada pelo “demixing”
decompor em soluções aquosas. da FM e pela adsorção de água.

6. Adsorventes mais baratos. 6. Solventes mais caros. Descarte mais caro.

Outros suportes polares
Kieselguhr, diatomita ou Terra de diatomáceas
Florisil
Alumina
Celulose
Poliamida
Polivinilpolipirrolidona (PVPP)
Sephadex
FASES LIGADAS (BPC)
R2 R2
Si OH + Cl Si R1 Si O Si R1
R2 R2

ODS, RP-18, C-18 Si O Si

O SILANOL RESIDUAL
H
SILANOL RESIDUAL
CH3
Si CH3
RP-8, C-8 Si O Si
CH3
SILANOL ENCAPADO (end-capped)
SILANOL ENCAPADO (end-capped)
CH3
CH3
HSi
Fenil Si O Si
CH3

TMS, C-1 Si O Si

Vantagens:
CN, Cianopropil Si O Si N
- Equilíbrio mais rápido
NH2, Propilamino Si O Si NH2
OH - menor adsorção irreversível
Diol Si O Si OH
- Água não influi na reprodutibilidade
SELETIVIDADE NPC X RPC
 Substâncias com grupos funcionais diferentes
Valor de maior em Sílica do que em C18
Valor de  menos distinto entre fases ligadas NPC e RPC
 Homólogos ou substâncias que diferem no no. de carbonos
Valor de  maior em RPC
 Isômeros
Valor de maior em NPC
SÍLICA
Características indesejáveis:
- Alto teor de silanóis livres (Si-OH).
- Contaminação superficial por metais (Fe, Al, Ni, Zn, etc.).
- Contaminação interna por metais (Al).

Características desejáveis:
- Maior teor de silanóis geminais e silanóis associados.
- Baixíssimos teores de metais contaminantes.

Sílicas tipo B -
Análises de substâncias básicas
SEPARAÇÃO DE HIDROCARBONETOS AROMÁTICOS
EM DIFERENTES FASES LIGADAS

CH3

5 m, esférica
5 m,
não esférica
encapada
não encapada

4 m, esférica
4 m, esférica
encapada
encapada

CH3

CH3

10 m, irregular
10 m, irregular
encapada
encapada
Separação de antidepressivos tricíclicos
CH3

N
H3C
11 N

22 NH
CH3

CH3

33 N
CH3
44 N
CH3

CH3 CH3

FM:
FM:30
30%%ACN
ACN
70
70 % TampãoFosfato
% Tampão Fosfatode
desódio
sódio0,025
0,025MM- -pH
pH2,5
2,5
++0,2 % de TEA e 0,2 % de TFA
0,2 % de TEA e 0,2 % de TFA
Coluna:
Coluna: 15 x 0,46cm
15 x 0,46 cm
CHAVE PARA ESCOLHA
DO ADSORVENTE (FE)
PM  GPC Sephadex

Iônica ou ÍON-PAR ou C18

Sol. em Água TROCA IÔNICA
Ionizável C8

SUPRESSÃO
C18
FASE
C8
REVERSA
CN
Não-iônica Si
FASE
CN
NORMAL
AMOSTRA NH2

Iônica ou ÍON-PAR ou C18

TROCA IÔNICA C8
Ionizável
POLAR** SUPRESSÃO

Insol. em Água FASE

C18
Não-iônica REVERSA
C8
CN

Si
FASE
CN
NORMAL
Sol. em NH2
APOLAR*
solv. orgânico
FASE C18
REVERSA C8

* Hexano, CHCl3
** AcOEt, MeOH PM  GPC Sephadex - LH20
Cuidados para extender o tempo de vida e
performance de uma coluna

1. Usar coluna bem empacotadas;

2. Evitar choques de pressão, térmicos e mecanicos;
3. Usar pré-coluna (guard column) e filtro de linha (in-line filter)
4. Purgar frequentemente a coluna com solvente forte;
5. Pré-tratar amostras “sujas” para evitar partículas e/ou componentes que possam ficar
fortemente retidos;
6. Usar FE estáveis (a mais indicada é C18);
7. Usar tampões ortânicos para pH intermediários (entre 6 e 8);
8. Usar temperatura < 40o C;
9. Manter o pH da FM entre 3 e 8;
10. Adicionar 200 ppm de azida de sódio em fases móveis aquosas e tampões;
11. Armazenar a coluna sem sais ou tampões, de preferência em solvente orgânico puro.