Técnicas de Separação Cromatográfica

Definição: Cromatografia é um método físico-químico de separação no qual os

componentes a serem separados são distribuídos entre duas fases, uma que
permanece estacionária e outra que se movimenta em uma direção definida
L. Ettre, Pure Appl. Chem. 65 (1993) 819.

Componentes do Sistema e o Processo

Fase Estacionária: a fase química que se mantêm na coluna (sistema

cromatográfico)

Fase Móvel (eluente): a fase química que se movimenta através da coluna

M. TSWEET (1903): Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas
recheadas com adsorventes sólidos e solventes variados.

Cromatografia = kroma [cor] + graph [escrever] (grego

Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes entre
uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).

Cromatografia em coluna (clássica ou

instrumental): a fase estacionária (F.E.) é
mantida em um tubo estreito através do qual
a
fase móvel (F.M.) é forçada a passar.
J. Chem. Ed. 1967, 44, 238.
A separação cromatográfica é obtida a partir de interações
diferenciadas entre analitos componentes da mistura, fase
estacionária e fase móvel.
A separação cromatográfica é obtida a partir de interações
diferenciadas entre analitos componentes da mistura, fase
estacionária e fase móvel.
A separação cromatográfica é obtida a partir de interações
diferenciadas entre analitos componentes da mistura, fase
estacionária e fase móvel.
A separação cromatográfica é obtida a partir de interações
diferenciadas entre analitos componentes da mistura e fase
estacionária e fase móvel.

Solutos que interagem mais fracamente ou

que não tenham interações com a fase
estacionária eluem mais rapidamente
A separação cromatográfica é obtida a partir de interações
diferenciadas entre analitos componentes da mistura, fase
estacionária e fase móvel.
 A separação cromatográfica é obtida a partir de interações
diferenciadas entre analitos componentes da mistura, fase
estacionária e fase móvel.

Solutos que interagem mais fortemente com a

fase estacionária demoram mais tempo a
passar através da coluna
 A separação cromatográfica é obtida a partir de interações
diferenciadas entre analitos componentes da mistura, fase
estacionária e fase móvel.

Cromatograma
Registro gráfico do processo cromatográfico

Resolução (Rs)

2.(tr2  tr1 )
Rs 
w1  w2
 Mecanismo de separação cromatográfica

Adsorção
Líquido sólido Líquido/gás sólido

+
-
+

-
+

INTERAÇÕES INTERMOLECULARES
Iônicas
Ponte de Hidrogênio
van der Waals Keeson (dipolo/dipolo)
Debye (dipolo/dipolo induzido)
London (dipolo induzido/dipolo induzido)
Mecanismos de Separação: ADSORÇÃO

A adsorção ocorre na interface entre a FM

(líquido ou gás) e uma FE sólida = fenômeno
interfacial

Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas

finas, poros)

Solutos polares

Sólidos com muitos sítios ativos (hidroxilas, pares de

eletrons...)
 Mecanismo de separação cromatográfica
Absorção (dissolução)

Absorção - separação baseada nas diferenças de solubilidade dos

componentes na fase estacionária (GC) ou entre a duas fases (LC)

Líquido/gás líquido
Mecanismo de separação cromatográfica
Permeação

Líquido/gás gel/sólido
Quanto ao objetivo da separação
Analítica - controle de qualidade (impurezas / pureza / doseamentos)
Preparativa - produção / purificação (evita as técnicas de extração química)

Quanto à composição da fase móvel

Isocrática - composição do eluente constante ao longo da eluição
Gradiente - composição do eluente varia de forma contínua

Quanto ao modo de operação

Análise por deslocamento
Fase móvel saturada com substância de maior afinidade para com a fase estacionária,
deslocando os componentes da amostra de acordo com os respectivos graus de afinidade.

Análise por eluição

A fase móvel passa continuamente na coluna arrastando a amostra e provocando o processo de
separação. A separação dos componentes da mistura depende apenas do seu coeficiente de
partição entre as fases móvel e estacionária

Análise por gradiente de temperatura

A separação é feita por um gradiente térmico no sentido da eluição da amostra isotérmica /
temperatura escalonada / temperatura programada linearmente
 VELOCIDADE DE MIGRAÇÃO DE SOLUTOS

- A magnitude da separação entre 2 componentes de uma amostra depende das

velocidades relativas nas quais as espécies eluem da coluna, que, por sua vez
depende das constantes de equilíbrio dos solutos entre as fases.
TEMPO DE RETENÇÃO (tR)

- O tempo de retenção de um soluto está relacionado com a força de interação do

mesmo com a fase móvel e a fase estacionária.

Uma combinação entre fatores de fluxo e fatores termodinâmicos:

tempo de retenção ajustado, t’R (termodinâmico);

tempo morto, tM (fluxo).

tR = t’R + tM [1]

O tempo de retenção de um soluto em uma dada coluna depende:

1) do comprimento da coluna
2) do fluxo da fase móvel
 CROMATOGRAMA
Representação gráfica do processo
(ou separação) cromatográfico.

t = 0  momento da aplicação da amostra

tm = tempo morto
tr = tempo de retenção
w = largura do pico
h = altura do pico
Definições
Fluxo: vazão da FM, geralmente em mL/min.
Tempo morto: tempo necessário para eluir uma substância que não
interage com a FE.
Volume morto: volume de FM necessário para preencher todos os
interstícios e poros da FE, ou volume de FM necessário para eluir uma
substância que não interage com a FE.
Tm = Vm/F
Tempo de retenção: tempo necessário para eluir uma substância de um
determinado sistema cromatográfico.
Volume de retenção: volume de FM necessário para eluir uma
substância de um determinado sistema cromatográfico.
Tr = Vr/F
 Resolução Rs
RESOLUÇÃO (Rs) expressa a separação efetiva entre dois picos
adjacentes

Separação completa e efetiva de dois picos cromatográficos depende

simultaneamente das suas retenções (tR1, tR2) e das suas larguras WA,
WB):
 (tr2  tr1 )
RESOLUÇÃO (Rs): expressa a separação Rs  2.
efetiva entre dois picos adjacentes ( w1  w2 )
 TÉCNICAS PARA MELHORAR A RESOLUÇÃO
Objetivo:
Separações eficientes em tempos de análise curtos.
1. Aumentar a distância entre os picos, ∆tR=t2-t1
(a) Aumentar o comprimento da coluna, L
(b) Aumentar a quantidade de fase estacionária,
(c) Usar um coeficiente de seletividade melhor, α=T2’/T1’
· Diminuir a temperatura
· Escolher uma fase estacionária diferente
· Escolher uma fase móvel diferente (se for líquida)
2. Diminuir a largura da banda, W
(a)Usar um enchimento mais uniforme
· Encher mais cuidadosamente
· Usar partículas mais pequenas
(b) Aumentar a área de interface entre as fases
(c) Optimizar a velocidade de fluxo
(d) Reduzir o tamanho da amostra
(e) Reduzir o espaço morto no sistema
(f) Reduzir a constante de tempo do detector
(g) Diminuir o diâmetro da coluna,,
 Efeito do diâmetro interno (di) da coluna
Para um mesmo comprimento (L) de coluna:

Volume do pico
1 g Volume do pico
Diminui o consumo
solvente  Capacidade de
amostra
 Detectabilidade
100 g
1 g
di di
Resolução cromatográfica: fatores envolvidos

k’: Fator de capacidade ou de retenção

nFE tr  tm
É a razão da distribuição do analito entre FE/FM k' ou k ' 
Quanto maior, maior a afinidade do analito pela
nFM tm
FE, em relação à FM.
α: Fator de seletividade k '2
É a razão entre os fatores de retenção de dois 
analitos. k '1
Quanto maior, mais fácil a separação.
N: Fator de eficiência
Relação entre tempo de permanência do analito
no sistema e alargamento da banda 2

cromatográfica.
2
 tr   tr 
N  16.  ou N  5,54. 
Quanto mais difícil a separação (α pequeno),  w  w1 
 2
maior N necessário.
Resolução cromatográfica:

N (  1) k '2
Rs  . .
4  (k '2 1)

EFICIÊNCIA
Depende da
configuração
do sistema
FATORES FÍSICOS

SELETIVIDADE RETENÇÃO
Dependem das características
da FM e FE do sistema
FATORES QUÍMICOS
Efeito do comprimento da coluna (L) e diâmetro da
partícula (d) sobre a eficiência

L
N max  0,4.
d
 DIÂMETRO PARTÍCULA L=15cm L=25 cm
m

m (130 m)  460 770

40 - 60 m (50 m )  1.200 2.000
20 m  3.000 5.000
10 m  6.000 10.000
m
m  12.000 20.000
m  20.000 33.300

Obs: Comprimento grande causa espalhamento e análise longa.

Partícula muito pequena necessita pressão muito alta.