Role of adipose tissue derived stem

cells differentiated into insulin

producing cells in the treatment of
type I diabetes mellitus
Rodolfo A. López
Seminario posgrado
DIABETES MELLITUS TIPO 1
MATERIALES Y MÉTODOS
Grupo Control 1:
Solución PBS

30 Ratas Grupo 2: Grupo

albinas diabético no tratado. Inducción de Medición de
diabetes con glucosa en la
Grupo 3: Grupo Estreptozotocina sangre
diabético trabado con
IPC.

14 días de acoplamiento 16-18 h 16-18 h

AISLAMIENTO DE EXPANSIÓN DE
ADSC
Tejido adiposo en PBS

1. Enjuagar con PBS

2. Cortar en trozos pequeños
3. Incubar con sln colagenasa al 0.075% Suspender las células
tipo IA. X 1h a 37°C. en DMEM + ant + 10%
4. Agitación cada 20 min. FBS

Filtrar
5. Retirar la parte superior de lípidos.
6. Centrifugar a 1000 g x 10 min. Cultivar en una placa
7. Lisar los glóbulos rojos con NH4Cl 160 mM de 10 cm 1x106
x 10 min. células
 MANTENIMIENTO Y
CARACTERIZACIÓN DE ADSC
Verificación de
viabilidad con azul de
tripano

Citometría de flujo

Imagen tomada de
https://www.thermofisher.com/co/en/home/life-science/cell-analysis/cell-analysis-learning-center/molecular-probes-school-of-fluorescence/flow-cytometry-basics/flow-cytometry-fundamental
s/how-flow-cytometer-works.html
Imagen tomada de
https://www.thermofisher.com/co/en/home/life-science/cell-analysis/cell-analysis-learning-center/molecular-probes-school-of-fluorescence/flow-cytometry-basics/flow-cytometry-fundamental
s/how-flow-cytometer-works.html
CARACTERIZACIÓN DE ADSC POR
CITOMETRÍA DE FLUJO
DIFERENCIACIÓN DE ADSC EN IPC

1. DMEM.
2. DMEM F12.
3. Nicotinamida.
4. Activina A.
5. Excendina 4.
6. Pentagastrina.
7. Factor de crecimiento de hepatocitos.
8. B 27.
9. Suplemento N-2.
10.Antibiótico.
EXPRESIÓN GÉNICA POR RT-PCR
Extracción de ARN Kit Rneasy

Síntesis de ADNc

0.2 µl de primer
Directo e inverso

0.2 µl de ADNc a
12.5 µl de SYBR 10.1 µl de agua
cada 25 µl mezcla
Gren Master Mix libre de DNAsa
de reacción PCR
EXPRESIÓN GÉNICA POR RT-PCR
MEDICIÓN DEL NIVEL DE GLUCOSA
MEDICIÓN DEL NIVEL DE GLUCOSA
ANÁLISIS BIOQUÍMICA DE
TRASPLANTE DE IPC IN VIVO
Arteria esplénica

FGB

Insulina en suero
TRANSCRIPCIÓN REVERSA PCR
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3

CD 90 0.7 ± 0.3 0.2 ± 0.02 0.9 ± 0.2

CD 105
0.5 ± 0.1 0.1 ± 0.03 0.6 ± 0.2

CD 44 0.9 ± 0.7 0.3 ± 0.05 1.2 ± 0.6

CD 44 0.5 ± 0.3 0.1 ± 0.04 0.7 ± 0.2

ANÁLISIS H&E
TINCIÓN TRICRÓMICA DE MASSON

Grupo 1 Grupo 2
TINCIÓN TRICRÓMICA DE MASSON

Grupo 1 Grupo 3
 EXPRESIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA
Desparafinar Incubar en H2O2 Incubar con PBS y Incubar con DAB
X 30 min. Suero de caballo anticuerpo primario
x 20 min rabbit anti-human C-
peptide antibodies

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3

RESULTADOS MORFOMÉTRICOS
CUANTITATIVOS

Programa analizador Leica

QWIN 500MCO