REACCIÓN TEMPRANA

DEL TEJIDO EN LA ZONA

DE TENSIÓN DEL
LIGAMENTO
PERIODONTAL DURANTE
EL MOVIMIENTO DENTAL
ORTODÓNTICO

Dr. Cristhian F. Ñustes P.

Dr. Andres J. Zafra M.
OBJETIVO
o Examinar la reacción temprana del tejido en la zona de
tensión del ligamento periodontal (PDL) durante el
movimiento dental ortodóntico.
CONCEPTOS BÁSICOS
o CITOQUINAS
o PTX3
o bFGF
o HISTOMORFOMETRÍA
o Las citocinas (también denominadas citoquinas) son proteínas
que regulan la función de las células que las producen sobre otros
tipos celulares.
o Su acción fundamental consiste en la regulación del mecanismo
de la inflamación.
 o expresión
La La proteína
de estarelacionada con laporpentraxina
proteína es inducida es una proteína
citoquinas inflamatorias queaen
en respuesta estímulos
los seres en
inflamatorios humanos estádecodificada
varios tipos por el gen
células mesenquimales y PTX3 . particularmente células
epiteliales,
oEs un miembro
endoteliales de la superfamilia
y fagocitos mononucleares. La depromueve
proteína pentraxinas .
la diferenciación de los fibrocitos y
o PTX3
participa en lase produce
regulación y inflamación
de la se liberay rápidamente por varios tipos de
la activación del complemento. También juega un papel
encélulas, en particular
la angiogénesis por fagocitos
y la remodelación mononucleares,
tisular. La proteína células
sirve como un biomarcador para varias
dendríticas
afecciones (DC),
fibroblastos y células endoteliales en respuesta a
inflamatorias
señales inflamatorias primarias
 factor de crecimiento de fibroblastos

o Es un factor de crecimiento que aumenta el índice de actividad

mitótica y síntesis de ADN.
o Facilita la proliferación de varias células precursoras, como el
condroblasto, colagenoblasto, osteoblasto, entre otras, que forman
el tejido fibroso, de unión y soporte del cuerpo.
o Es la cuantificación de la microestructura del tejido óseo. A
través del recuento y medición de las características
histomorfológicas se puede obtener información acerca del
recambio óseo (remodelación), de la microarquitectura y de la
actividad celular dinámica y estática
 INTRODUCCION
o En ortodoncia, se han realizado numerosos estudios sobre reacción tisular del
ligamento periodontal (PDL) durante el movimiento dental ortodontico.
o La mayoría examinó la reacción del tejido en el zona de presión de PDL:

• (Goldman y Gianelly, 1972; Noda, Nakamura,

Kogure y Nomura, 2009; Rygh, 1972; Reitan,
Morfológicamente 1960).

• (Baba, Kuroda, Arai, Nakamura, y Sato, 2011).

Histoquímicamente

•(Krishnan y Davidovitch, 2006).

A nivel molecular
o Hay pocos estudios sobre la reacción del tejido en la zona de
tensión del PDL, en comparación con aquellos en la zona de
presión.
oEstos estudios mostraron que las fibras periodontales se estiraron
y los osteoblastos se activaron formando hueso nuevo a lo largo de
la superficie del hueso.
oSe demostró la localización de IL-1b en zona de tensión de PDL durante el
movimiento dental y sugirió que IL- 1b podría estar estrechamente asociado
con la respuesta de las células PDL a fuerzas de tensión.
oIL-1b es una de las citoquinas inflamatorias típicas, estrechamente
relacionado con el inicio de la inflamación aguda (Dinarello, 1996;
Oppenheim, Kovacs, Matsushima y Durum, 1986).
oPentraxina 3 (PTX3), que se expresa principalmente por las células
endoteliales de la sangre vasos, es un nuevo biomarcador de enfermedad
vascular inflamatoria

oLa expresión de IL-1b y PTX3

aumentan con la estimulación
inflamatoria.
obFGF es uno de los factores de crecimiento que juegan un papel
importante en el diferenciación de los osteoblastos
o(IL – 1b, PTX3) Son esenciales para la reorganización del sistema
de fibras del PDL y la remodelación de hueso alveolar en la zona
de tensión del ligamento periodontal.

Zona de tención
 In – vivo

MATERIALES Y METODOS
El protocolo experimental fue
realizado en animales.

Fue aprobado por el Comité

Diseño experimental Institucional de Cuidado y Uso de
Animales de la Universidad Tsurumi
y llevado a cabo de conformidad con
las Directrices para Experimentación
animal de la Universidad Tsurumi.
 49 ratas wistar machos
(300-320 gr, 10 semanas)
Campo libre de patógenos

Jaulas vivarium.
12h luz, 12h oscuridad
Alimento y agua a libre demanda

Experimental Experimental Experimental Control

N=12 N=12 N=12 N=13

Aparatología M1 superior.
Las ratas fueron anestesiadas con una inyección
intraperitoneal de 1 ml / kg pentobarbital sódico

Observación

24h: n=12
3d: n=12
7d: n= 10
El aparato de ortodoncia se fijó con
acero inoxidable helicoidal calibre
0.012 en los incisivos superiores
con resina adhesiva dental

La magnitud de la fuerza inicial la

de ortodoncia fue de
aproximadamente 0.1 N.

Para aplicar la fuerza de ortodoncia,

el resorte fue cuidadosamente unido
a una muesca preparada por fresa
con punta de diamante en la
superficie lingual de la primera
corona molar.
Preparación para histología e
inmunohistoquímica
 Tres ratas de cada grupo Cinco ratas de cada una
: control , de 24 horas, en los grupos : control ,
de 3 días. de 24 horas, 3 días, 7
días para estudio
para estudio histomorfométrico e
histológico inmunohistoquímico

Fueron perfundidos con 0,1 de paraformaldehído , con fosfato

(pH 7,4) fijado (30 minutos para el estudio histológico, 10
minutos para estudio histomorfométrico e inmunohistoquímico) a
través de su aorta ascendente bajo anestesia profunda con
pentobarbital.

https://www.youtube.com/watch?v=QNXfrBewxfM
 Se retiran los aparatos

Los maxilares fueron disecados y recortados en bloques más

pequeños donde estuvieran presentes los primeros molares

Todos los bloques fueron descalcificados en EDTA al 10% durante 3

semanas

Luego se deshidrataron en etanol e incrustado en parafina. Los bloques

fueron seccionados transversalmente para obtener cortes de 6 mm.

(histomorfometria e
inmunohistoquímica) toluidina
azul
(histología) hematoxilina-eosina y
azan para observar las fibras de PDL
PDL en el área cervical de la raíz medial en la
parte superior primer molar
Histomorfometría

 Un área de 600 x 800um2

incluyendo el máximo estirado en
el PDL cerca del centro en el lado azul de toluidina
lingual fue seleccionado para la
medición dos secciones en cada
grupo, dando 10 medidas en total
Todas las áreas transversales del
PDL y los vasos sanguíneos se
midieron con Photoshop

Imagen de procesamiento de computadora extraída de la PDL y

áreas de sección transversal vascular
 Inmunohistoquímica

IL-1b, PTX3 y bFGF se Las secciones se incubaron

detectaron mediante el con el anticuerpo primario
uso de anticuerpos durante 90 min a 50° C, y
primarios policlonales de luego con un micro
conejo (dilución 1: 100; polímero vinculado a
Bioworld Technology, anticuerpos secundarios.

Las otras secciones se

Las secciones para incubaron durante30 minutos
inmunohistoquímica se en 3% de H2O2 para detener
tiñeron con toluidina la actividad de la peroxidasa
azul para la orientación. endógena y luego bloquearla
con suero de caballo durante
20 minutos.

https://www.youtube.com/watch?v=QNXfrBewxfM
 Microdisección de captura láser (LCM)
24h
Al final del periodo experimental Maxilar de 5 ratas de cada grupo 3d
7d

Los tejidos fueron recortados con un disco de Disecados y sumergidos rápidamente en

diamante en bloques mas pequeñosLa microdisección
incluyendo M1 láser, tambiénisopentano
conocida como LMD o con
enfriado LCM nitrógeno
(microdisección por captura láser), es un método de contacto
liquido
sin contaminación para aislar células individuales específicas
o áreas enteras
Los tejidos congelados fueron incrustados de tejido de
en compuesto y una gran variedad de muestras de
tejido
posteriormente se utilizó nitrógeno líquido hasta que el compuesto
estaba completamente congelado.

Los bloques congelados de las veinte ratas se montaron en trozos Cortes en serie de 7 µm de espesor
preenfriados a -25°C en un criostato con compuesto y seccionado fueron recogidos individualmente
transversalmente con un cuchillo de acero de tungsteno súper duro. con cinta adhesiva de gran alcance
(método Kawamoto) en el criostato.

https://www.youtube.com/watch?v=mXfv0D7Gc3Q
 Los cortes congelados se fijaron con 100% etanol
durante 1 minuto.

El PDL en la zona de tensión se microdiseccionó, equipado con un láser de

nitrógeno (337 nm) para cortar, extirpar y recolectar tejidos mediante tecnología
de catapulta a presión láser (Nakamura et al., 2007) (Fig. 1f, g).

Se utilizó un solo disparo de láser para posterior extracción de ARN. Se tomaron

muestras de aproximadamente 10 cortess Las muestras del grupo de control (sin
movimiento dental) también fueron recogidos de la misma manera.

Microdisección por captura láser (LCM) de la PDL en la sección congelada.

Aislamiento de ARN y RT-qPCR

 Después de que el PDL se diseccionó en cada muestra, el ARN fue extraído utilizando el
RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.
 El análisis de PCR se realizó con One Step SYBR PrimeScript RTPCR Kit II (TaKaRa Bio
Inc., Japón) en un termo Cycler Dice Real Time , usando los cebadores descritos en Tabla
1.
Primera secuencia 5`3` Tamaño (bp) Referencia
Gen adelante CCCTGCAGCTGGAGAGTGTGG 152 Zhang et al. (2014)
  atras TGTGCTCTGCTTGAGAGGTGCT
PTX3 Adelante TCAAAGCCACAGACGTATTAAACA 103 Okutani et al. (2007)
A

Atrás AAACACTAGGGACTGGGAACTTAG
G

bFGF Adelante GCGACCCACACGTCAAACTACAGC 231 Fuentes, Opperman,

  Bellinger, Carlson, &
Hinton (2002)
atrás ACTGCCCAGTTCGTTTCAGTGCCA

GAPDH Adelante CAACTCCCTCAAGATTGTCAGCAA 113 Choi, Arai, Ishikawa,

atras GGCATGGACTGTGGTCATGA Shimoda, &
Nakamura (2011)

https://www.youtube.com/watch?v=TalHTjA5gKU&t=59s
 Las condiciones de PCR fueron de 95 ° C durante 30 s, 45 ciclos de
desnaturalización a 95 ° C durante 5 s y recocido y extensión a 60 ° C
durante 30 s, seguido de disociación y una desnaturalización estándar curva.

 La cantidad de ARNm de cada gen en cada muestra se cuantificó

extrapolando de la curva estándar para cada gen, como se describe en un
estudio previo (Arai, Ohnuki, Umeki, y Saeki, 2005).
 Todas los experimentos se repitieron por triplicado usando ARN extraído de
cinco muestras independientes
RESULTADOS
Observación histológica

 Secciones fijadas por perfusión del PDL del primer área molar en el grupo de control mostró que el
PDL se interpuso entre la raíz y hueso alveolar.
 Osteoblastos y cementoblastos fueron vistos en las superficies del hueso y el cemento,
respectivamente.
 Los fibroblastos se dispersaron en el PDL (Fig. 2a).
 Las fibras periodontales mostraron una disposición de malla y cada fibra PDL mostró una
configuración ondulada en el PDL, especialmente en el tercio medio (Fig. 2b)
 Hay cambios estructurales en el PDL 24 h después de la fuerza ortodóntica (Fig. 2c). En la zona de
tensión (PDL cervical lingual), el espacio periodontal se había ampliado considerablemente y los
elementos celulares parecían alargarse entre las fibras periodontales.
 Los vasos sanguíneos también se vieron alargados entre las fibras periodontales. La disposición
típica ondulada de las fibras periodontales se perdió y las fibras periodontales estaban
extremadamente estiradas entre el hueso y la raíz (Fig. 2d).

24 horas
 Tres días después de la carga de la fuerza de ortodoncia, la expansión el
espacio periodontal se estrechó ligeramente y la disposición de la fibra
periodontal parecía estar relajada entre el hueso y la raíz, en comparación
con las observaciones 24 h después de la fuerza ortodóntica. No hubo signos
de elongación en la apariencia delos vasos sanguineos.
Histomorfometría

 En imágenes seleccionadas del PDL, los vasos sanguíneos se revelaron

como círculos blancos dispersos en el PDL para todos los períodos
experimentales (Fig. 3a-d).
Áreas transversales totales del PDL a las 24 h, 3 días y 7 días
fueron significativamente más grandes que las del grupo control
Las áreas totales transversales de los vasos sanguíneos mostraron una
ligera disminución después de la carga de la fuerza de ortodoncia, pero la
disminución no fue significativamente diferente entre los grupos
 Observación inmunohistoquímica
 Análisis inmunohistoquímico de secciones teñidas con azul de toluidina
reveló los cambios de superficie del hueso, así como la cambios en el PDL.

 Aunque no hubo cambios detectables en

el superficie ósea 24 h después de la
carga de ortodoncia , un cambio fue
evidente en la superficie del hueso tres
En histología, el osteoide es la porción orgánica
días después.
sin mineralizar de la matriz ósea que se forma

con anterioridad a la considerable
Una capa maduración delde osteoides
tejido óseo
nuevos con tinción metacromática se
había producido a lo largo de la superficie
del hueso calcificado
 los osteoblastos se alinearon a lo largo de la capa osteoide.
 Después de siete días, el espacio periodontal se hizo más estrecho
 Todavía se observó en la superficie del hueso calcificado y los osteoblastos
eran presente a lo largo del osteoide.
.
 El análisis inmunohistoquímico demostró diferentes aspectos en la reacción tisular de la
PDL. No hubo una ubicación característica del IL-1b en el secciones de control de PDL
(Fig. 6f). Sin embargo, 24 h después de la ortodoncia carga de fuerza, se observó IL-1b a lo
largo de PDL

IL-1b
PTX3 se detectó en las células endoteliales y también en las células alrededor de los vasos
sanguíneos.. La ubicación de PTX3 en el PDL 24 h después de la carga de la fuerza de ortodoncia fue
bastante diferente en el control.

24 horas
control
El PTX3 fue detectado no
solo en el células
endoteliales y las células
alrededor de los vasos
sanguíneos, sino también
en el fibroblastos a lo largo
de PDL
 Tres días después de la carga, la ubicación en las células endoteliales fue similar a la de
24 h después carga (Fig. 6m, m-H). Pero su intensidad en los fibroblastos parecía ser
más débil a los 3 días que a las 24 h..

PTX3 desapareció de la
mayoría de los fibroblastos
Siete días después de la
3 días 7 días carga de la fuerza de
ortodoncia, PTX3 se localizó
en las células endoteliales y
las células alrededor de los
vasos sanguíneos, que era
similar a la de la sección de
control (Fig. 6n)
bFGF se localizó en las células alrededor de los vasos sanguíneos en el
sección de control, pero su reacción parecía débil. Después 24 h de carga de
fuerza de ortodoncia, bFGF se localizó en las células a lo largo de la PDL, así
como las células alrededor de los vasos sanguíneos (Fig. 6q, q-H)
Pero 3 y 7 días después de la carga de la fuerza de
ortodoncia, fue detectado en las células alrededor de los
vasos sanguíneos
 Análisis RT-qPCR RT-qPCR

Este estudio apoyó evidentemente las observaciones

inmunohistoquímicas a nivel genético Demostró una regulación positiva
significativamente más alta de IL-1b 24 h después de la carga de fuerza
ortodóntica
Luegoendisminuyó
la PDL drásticamente para controlar el nivel, 3 y 7
días después de la carga de la fuerza de ortodoncia.
La PTX3 también mostró una regulación positiva similar a IL-1b
(Figuras 7b y 8b). Pero la regulación positiva significativa se
observó adicionalmente 3 días después carga, aunque su
regulación positiva fue significativamente menor que a las 24 h
La expresión de PTX3 luego disminuyó al nivel de control, 7 días
después de la carga de la fuerza de ortodoncia. RT-qPCR mostró que
bFGF estaba significativamente regulado al alza 24 h después de la
carga de la fuerza de ortodoncia (figuras 7c y 8c). Su expresión
disminuyó al nivel de control, 3 y 7 días después de la carga.
DISCUSIÓN El objetivo de este estudio fue examinar la reacción
patológica en la zona de tensión de PDL durante el
movimiento dental. Por lo tanto, la expresión de IL-
1b, una citocina inflamatoria típica, se utilizó para
examinar la reacción tisular de la PDL

Los las fibras periodontales se estiraron entre el hueso

alveolar y cemento y osteoblastos activos estaban presentes a
lo largo del hueso superficie. Osteoide se formó en la
superficie del hueso 3 y 7 días después carga de fuerza de
ortodoncia.
 La histomorfometría también mostró una expansión significativa del
espacio PDL en los grupos experimentales. La zona de los vasos
RT-qPCR demostrado expresión significativamente alta de IL-1b, un agente
sanguíneos en el PDL no mostró ningún cambio significativo. Los
inflamatorio típico citoquina en la zona de tensión de PDL 24 h después de la
cambios significativos de la relación (vasos sanguíneos / PDL) se
fuerza ortodóncica carga, aunque los hallazgos morfológicos fueron similares a
debieron
los de a la convencionales.
los hallazgos expansión del espacio PDL. Estos indican que la
circulación sanguínea es mantenido en la zona de tensión del PDL
24 h después de la ortodoncia carga forzada
 La expresión de PTX3 en esta situación podría evitar el
engrosamiento del endotelio células, mejorar la
circulación sanguínea y promover la reconstrucción
rápida de la PDL. La alta expresión de PTX3 en los
fibroblastos está involucrada en la remodelación de la
matriz celular en los fibroblastos

La reacción inflamatoria aparentemente

disminuyó en la zona de tensión de PDL 3
días después de la carga de la fuerza de
ortodoncia
 Las observaciones 3 días después de la fuerza de ortodoncia carga
fueron bastante diferentes de los observados 24 h después de la
cargando. El espacio periodontal expandido se redujo ligeramente
y la disposición de la fibra estirada se relajó en el PDL

Cambios fueron inducidos por la rápida

formación de hueso en la superficie del hueso en
el PDL, porque se había formado una Esto puede ser apoyado por
considerable capa de osteoide en la superficie del la recuperación a un nivel
hueso 3 días después de la carga de la fuerza de normal de IL-1b
ortodoncia
 Conclusión
Los eventos en la zona de tensión de PDL están en
contraste con los observados en la zona de presión de
PDL, donde la sangre la circulación se interrumpe y las
células y los tejidos se ven obligados a sufren necrosis
los celular y degeneración
resultados tisularque la reacción temprana en la
presentes sugieren
zona de tensión del PDL durante el movimiento dental consiste de
dos fases: primero, inflamación y segundo, recuperación rápida y
renovación del PDL con formación de hueso
GRACIAS !!!