BIOLOGIA MOLECULAR

APLICADA

Dr. Vicente Chambilla Quispe

Dpto de Biología-Microbiología
de la Facultad de Ciencias
de la Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann
 Que es la biología molecular?
• Estudio de la biología a nivel molecular

Se superpone con áreas de

la biología y la química, en
particular genética y
bioquímica

• Estudio de los procesos celulares

De la genética clásica a la biología molecular

al diagnóstico especializado……
 CRONOLOGÍA

Genética AM y DM

Mendel 1866
 GENÉTICA AM

 Las partículas de la herencia se

mezclaban

 Un parental aporta más que el otro

 Herencia de caracteres adquiridos

MENDEL Y LOS “FACTORES”
DE LA HERENCIA
 GENÉTICA DM

LA GENÉTICA Y

LOS GENES......
ADN o PROTEÍNAS?

….en busca del material hereditario….

Que características debería presentar
el material hereditario?

 Perpetuarse (replicarse)
 Manifestarse (expresarse)
 Cambiar (mutar)
 Combinarse (recombinarse)
 1902-Theodore Boveri- William Sutton
1865

Establecen la hipótesis según la cual los cromosomas,

segregados de modo mendeliano,
son unidades hereditarias.
1865 1915 - T.H. Morgan

Los genes se
disponían
linealmente en el
cromosoma

Se comienza a hablar de genética.....

 1865 1928 - Frederick Griffith
Colonias “Rugosas” Colonias “Lisas”

Transformación de
Streptococcus pneumoniae
Células L Células L muertas por
Células L Células R muertas por
calor junto a celular R
vivas vivas calor vivas
cápsula
Bacteria

“factor de
Inyección
transformación”
Resultados
 1865 1944 - Avery, MacLeod & McCarty

El ADN purificado es “el factor de transformación”

El ADN de las células lisas

transformaba a las rugosas

Oswald Avery Colin MacLeod Maclyn McCarty

Su teoría fue rechazada por dos razones:

De ser así cada especie debería tener un

tipo diferente de ADN

La composición química del ADN era

demasiado simple para
contener toda la información para la vida
1865 1952 - Hershey & Chase
El ADN viral (no las proteínas) programa
las células

Martha Chase & Alfred Hershey Bacteriófagos

… “los genes se componen de ADN, base

química de la herencia”…
LA ESTRUCTURA DEL ADN...
 1865
1947 - Erwin Chargoff

Las bases de ADN siguen

ciertas reglas
 La composición es especie
específica
 A = T, C = G en todas las especies

AT GC
1865 1953 - Franklin & Wilkins
La naturaleza helicoidal del ADN

Rosalind Franklin
Film
fotográfico
Fuente de rayos X

DNA cristalizado

Maurice Wilkins
 1865 1953 - Watson & Crick
Descripción de la estructura tridimensional
del ADN

Francis Crick & James Watson

1865 1953 - Watson & Crick
Que dedujeron de:
Datos de R. Franklin
• hélice doble
• ancho uniforme de 2 nm
• bases separadas por 0.34 nm

Chargoff
• la adenina se aparea con la
timina
• la citocina se aparea con la
guanina
 1865 1953 - Watson & Crick

Que dedujeron ellos

mismos?
• Las bases están hacia adentro,
y los fosfatos y las azúcares
hacia afuera
• Enlaces de hidrógeno
• Hebras antiparalelas
• Sugirieron un modo semi-
conservativo de replicación
 ESTRUCTURA DEL ADN

... 2 de abril de 1953,

Molecular Structure
of Nucleic Acids.
A Structure for Deoxyribose
Nucleic Acid.
Nature 171: 737.
No más de 900 palabras…..

J. D. WATSON and F. H. C. CRICK

 QUE ES EL ADN???

POLÍMERO LARGO,

NO RAMIFICADO,

COMPUESTO POR
CUATRO TIPOS
DE SUBUNIDADES

Bases nitrogenadas
Se combinan con
azúcares y fosfatos
 DESOXIRIBONUCLEÓTIDOS
Nucleótido=base+azúcar+fosfato MONÓMERO
Nucleósido=base+azúcar
Del nucleótido al ADN
ENLACE FOSFODIESTER ENTRE
EL CARBONO 5´ DE UNA
DESOXIRRIBOSA CON EL GRUPO
FOSFATO DEL SIGUIENTE
NUCLEÓTIDO FORMANDO UN
5´ NUCLEÓTIDO MONOFOSFATO.

EL POLÍMERO SE FORMA AL
ENLAZAR LOS FOSFATOS AL 3´
DEL OTRO NUCLEÓTIDO

DIRECCIÓN
(5´a 3´)
5´
 Estructura estabilizada por
puentes hidrógeno •Doble hebra

3´ 5´ •Antiparalela

5´ 3´
ESTRUCTURA PRIMARIA
 Apareamiento:
A-T
G-C

Polímero uniforme
10 bases por Surco menor
vuelta

Surco mayor

ESTRUCTURA SECUNDARIA
 REGION
REGULATORIA

Codón de iniciación Codón de terminación

1865
ADN en Procariotas

ESTRUCTURA
TERCIARIA

Cromosoma bacteriano
ADN doble cadena (1mm long)
circular
cerrado
Condensado y ordenado (“supercoiled” o superenrollado)
1865 Plásmidos en Procariotas

• Tamaño de 1 a 400Kb
• Cantidad variable de copias en una célula
• Origen de replicación propio
• Pueden movilizarse a otros genomas
• Puede integrarse al cromosoma bacteriano
1865
ADN en Eucariotas

•1 o más cromosomas de ADN (hasta 1200 en helechos)

•Localizado en núcleo
•Empaquetado por histonas y otras proteínas cromatina

Moléculas de ADN en mitocondrias y cloroplastos

 LOS CROMOSOMAS

• Todas las células tienen el

material genético en forma
de ADN.(Acido
desoxirribonucleico)
• El ADN es la molécula
química donde se localiza
la información de la célula.
• Los cromosomas son
fragmentos de ADN
organizados en “ovillos”.
 LOS CROMOSOMAS
• Solo se hacen visibles cuando la célula va a
dividirse

             

                               
                               
                          
EL ADN JUNTO A SUS PROTEÍNAS SE ORGANIZA EN CROMOSOMAS
DURANTE LA DIVISIÓN CELULAR (POR ESPIRALIZACIÓN Y
ACORTAMIENTO EN SU LONGITUD)

CUARTO NIVEL:
“Cromosoma”: 50.000 veces
más cortos que toda la extensión
de su DNA contenido)
 Estructura del cromosoma metafásico
El cromosoma metafásico está constituido por dos cromátidas unidas por el centrómero
que divide al cromosoma en dos brazos.
Centrómero

BRAZO Cinetocoro

Constricciones
secundarias

BRAZO

Bandas
Telómero
 LOS CROMOSOMAS
• El número de cromosomas de cada especie es fijo
• En la especie humana hay 23 parejas de cromosomas. 22
parejas son AUTOSOMAS y la pareja 23 son los
CROMOSOMAS SEXUALES.
• Un cromosoma de cada pareja proviene de cada uno de los
progenitores (CROMOSOMAS HOMÓLOGOS)
 El ciclo celular
Fase permanente en células
que no entran nunca en mitosis. Síntesis de proteínas y
Estado de quiescencia. aumento del tamaño celular.

Fase G11
Fase G00
Replicación del ADN y
síntesis de histonas.
Citocinesis

División del
Fase S
citoplasma

Interfase
Fase de
mitosis

División celular

G1: 4 HORAS
Transcripción y traducción de genes que
Fase G22 S: 9 HORAS
codifican proteínas necesarias para la
división. Duplicación de los centriolos
G2: 4 HORAS
MITOSIS: 1 HORA
 1865 Replicación del ADN

Semiconservativa:
dos hebras generan una copia cada
una
 Iniciación
1865

comienza siempre en una secuencia específica de nucleótidos

conocida como origen de replicación,
en el que hay un gran contenido de adenina y timina.
 Iniciación
1865

iniciador
Síntesis de primers
de ARN
Iniciación de la
Unión de replicación
iniciador

Horquillas se mueven en
dirección opuesta

Formación de
dos hebras de
replicación

ADN lineales
(Eucariotas)
ADN circulares Varios replicones
(Procariotas)
Origen de replicación (oriC)
 Elongación
1865

ADN primasa
ARN primer
ADN polimerasa
ADN ligasa
III

Hebra
retrasada

Frag. de Okazaki

Hebra líder
Topoisomerasa

ADN polimerasa III

Helicasa
Proteínas de unión al ADNss
La ADN polimerasa sintetiza las nuevas cadenas, complementarias a cada
una de las cadenas primitivas, en sentido 5´ → 3´ partiendo de un ARN corto
específico llamado ARN cebador –molécula formada por nucleótidos de ARN
catalizados por ARN primasas- que determina el punto por donde la ADN polimerasa
comienza a añadir nucleótidos.
 Terminación
1865

Fragmentos de Okazaki

Ligasa

Cuando una ADN polimerasa hace contacto con el extremo de otro fragmento
de Okazaki contiguo, el ARN cebador de este es eliminado y otra enzima, la ADN ligasa,
conecta los dos fragmentos de Okazaki de ADN recién sintetizado, catalizando
las reacciones de condensación que unen los grupos fosfato y azúcar de los
nucleótidos contiguos y así, una vez unidos todos los fragmentos de Okazaki
se completa la doble hélice de ADN.
1865 1957 - Francis Crick
Propuso el dogma central
ADN

ARN

PROTEINAS

Transferencia de información
biológica
1865
El ADN y el ARN

•Ácidos nucleicos
•Macromoléculas
•Polímeros (monómero de nucleótidos)
•Uniones fosfodiéster
•Moléculas más grandes que se conocen.
 Diferencias entre la química del ADN y el ARN
1865

 El ARN tiene como carbohidrato a la ribosa

en lugar de la desoxirribosa.

 El ARN tiene como base el uracilo en lugar

de la timina.

Una célula típica contiene 10 veces más ARN que ADN.

 El ARN no es una doble cadena excepto en algunos virus.

1865 Estructura del ARN
 1865
Tipos de ARN según sus funciones

Componente principal del ribosoma

ARNr
(ribosomal)

•Decodifica el ARNm para sintetizar las proteínas

•Interacciona con ARNt durante la traducción
•En Procariotas, dos subunidades principales 30Sy 50S
•En Eucariotas, 40S y 60
 1865
Tipos de ARN según sus funciones

ARNt
(de transferencia)
aa

•Encargados de transportar los aminoácidos a los ribosomas

para incorporarlos a las proteínas, durante el proceso de
síntesis proteica.
•Decodificación mediante apareamiento con el codón del
ARNm

anticodón
1865
Tipos de ARN según sus funciones

ARNnc o ARN no codificante: ARN funcional que no codifica para síntesis proteica
(ARNr y ARNt)

ARN corto de interferencia (siARN: del inglés: small interfering RNA ): son
componentes de una gran respuesta antiviral denominada interferencia del ARN
involucrados en la regulación.

Ribo-llaves (ribo-switches): son formas de ARN que actúan como llaves "encendido-
apagado" de gran precisión.
ARN catalíticos o ribozimas: ARN con estructura secundaria que le confiere a la
molécula propiedades catalíticas como corte de ARN o ADN y ligación.

El ARN posiblemente
fue el primer biopolímero
que apareció en la corteza terrestre
durante el transcurso de la evolución.
Como se leen los ARNm??
 1961- Nirenberg y Ochoa
1865

Sistema libre de células

UUUUUUUU fenilalanina
AAAAAAAA lisina
CCCCCCCC prolina
GGGGGGG glicina
El código genético

43=64
ARNm
 Demostraron que hay 61 tripletes -o codones-
que codifican aminoácidos,
muchos de los cuales son codificados por más de un codón,
por lo que se dice que el código está degenerado.
y los tres restantes no son codificantes sino que son utilizados
como señales de terminación.
1865
TRANSCRIPCIÓN

ADN Requerimientos:
 Cadena de ADN
como matriz
 ARN polimerasa
ARN  Ribonucleósidos
trifosfatos
 Región promotora
PROTEINAS
 TRANSCRIPCION

ARN polimerasa

ADN
Principio de un gen

Iniciación
La ARN polimerasa junto a factores de transcripción se une a sitio donde
va a iniciar la transcripción
 Promotor

En bacterias
•Dos regiones conservadas en el ADN (-10 y -35) que son
reconocidas por factor sigma.
•ARN polimerasa luego se une y sintetiza ARN de 5´ a 3´
•Un promotor expresa varios genes (OPERÓN)
 Promotor en Eucariotas

•Región promotora

•Involucra varios
factores de
transcripción
(proteínas)

•Cada gen tiene su

promotor
 TRANSCRIPCION
Hebra antisentido
Dirección de la transcripción
3´del gen
5´del gen
5´del ARNm

3´ del ARNm
Hebra sentido: ARNm
contiene la información
genética
Hebra antisentido:
provee el molde para
la síntesis del ARNm
Elongación
Una cadena de ARN se une por apareamiento de bases a la cadena de ADN
y la ARN polimerasa es la encargada del enlace fosfodiéster.
 TRANSCRIPCIÓN
La ARN polimerasa
deja el ADN

ARN mensajero liberado

El ADN se aparea nuevamente

Terminación
Desestabilización del •Rho-independiente (Secuencias palindrómicas del ADN que en
complejo estadio de ARN adopta una estructura en horquilla)
ARN-ADN •Rho-dependiente (mediada por la proteína)
1865
TRADUCCIÓN

El nombre proteína proviene

de la palabra griega proteios,
que significa lo primero.
ADN

ARN

PROTEÍNAS

Las proteínas son macromoléculas

formadas por aminoácidos
 TRADUCCION
ARNt Sitio de unión
al aminoácido

Uniones hidrógeno entre

pares de bases

Iniciación
La iniciación procariótica es el resultado de la asociación de las subunidades pequeña
y grande del ribosoma y el acoplamiento del primer aminoacil-ARNt (fmet-ARNt)
con el codón de iniciación mediante el emparejamiento de bases anticodón-codón.
 TRADUCCION

Elongación
La elongación de la cadena polipeptídica
consiste en la adición de aminoácidos al extremo carboxilo de la cadena.
 TRADUCCION

Continua la elongación

Este proceso continua hasta

Polipéptido que llega a un codón stop
Creciente
 TRADUCCION

Nueva proteína sintetizada

Carboxilo terminal
Amino terminal

Terminación
La terminación ocurre cuando se llega a uno de los tres codones de terminación
del ARNm, que no son reconocidos por ningún ARNt.
 QUÉ ES UN GEN ?

Un segmento de ADN que contribuye a un

fenotipo/función. En ausencia de una función
demostrable, un gen puede ser caracterizado por
secuencia, transcripción u homología.

Human Gene Nomenclature Committee

 En Procariotas.....

Operón
Transcripción policistrónica (ARNm de varios genes)
 En Eucariontes...

REGION
EXONES
REGULATORIA

FIN
+1 TRANSCRIPCION
INTRONES

Un promotor para cada gen

LA DECADA DE LOS 70
 1865 1970 - Smith & Nathans
Descubrimiento de las enzimas de restricción

Hamilton Smith
• Descubrió HindII en
Haemophilus influenzae

Daniel Nathans
• Utilizó HindII para hacer el
primer mapa de restricción del
SV40
 1865 1972 - Paul Berg
El primer ADN recombinante utilizando EcoRI
Sitios de reconocimientoEcoRI

DNA
plasmidico
EcoRI corta el DNA en
fragmentos

Extremos
pegajosos SV40 DNA

DNA ligasa
DNA
recombinante
 1865 1973 - Boyer, Cohen & Chang
Transformación de E. coli con plásmidos
Gen resistente a la canamicina
recombinantes
Plasmid Gen resistente a
pSC101 la tetraciclina
Stanley Cohen &
Annie Chan

Medio con canamicina y tetraciclina

E. coli
transformada con
plásmidos
recombinantes Sólo crecen colonias recombiantes Herbert Boyer
 1865 1977 - Genentech, Inc.
La primera proteína humana producida por una
bacteria transgénica (somatostatina)
• Compañía fundada por
Herbert Boyer y Robert
Swanson en 1976
• Considerada el
advenimiento de la edad de
la biotecnología
LA DECADA DE LOS 80
1865

1980
• La suprema corte de U.S. permite patentar formas de
vida

1985
• Se prueban plantas modificadas genéticamente

En 1988 el National Center for Biotechnology

Information (NCBI) y el GenBank

Margaret Dayhoff
LA DECADA DE LOS
90
 1865 LOS 90: GENOMAS Y CLONES

1995
• primer genoma: Haemophilus influenzae.

1996
• Genoma de Saccharomyces cerevisiae

•1997
• Se clona Dolly

1998
• Genoma de C. elegans
 Clonación y Células Madre

Reproducción

Fecundación

Embriogénesis  Tipos de Clonación

 Aplicaciones de la
Clonación
 Tipos de Células
Madre
 Aplicación de las
Células Madre
 Clonación

Clonación Reproductiva

Clonación Terapéutica
 Definiciones
¿Qué es la clonación?
 

En distintos contextos de la Biología:

  Si nos referimos al ámbito de la Ingeniería Genética, clonar es
aislar y multiplicar en un tubo de ensayo un determinado gen o,
en general, un trozo de ADN.
 
La primera acepción viene del griego brote para calificar
cualquier organismo descendiente engendrado asexualmente (sin
fecundación) y cuya información genética proviene de un solo
progenitor, no de la combinación de los genes del padre y la madre.
Es una copia exacta de su original biológico. Individuos
genéticamente iguales. No constituye una manipulación genética ya
que no existe alteración del ADN ni de los genes. El genoma
Reproducción Artificial Asexual
permanece intacto.
 Tipos de clonación

1.Partición (fisión) de embriones tempranos:

Analogía con la gemelación natural. Los individuos son muy
semejantes entre sí, pero diferentes a sus padres. Es preferible emplear
la expresión gemelación artificial, y no debe considerarse como
clonación en sentido estricto. Ocurre naturalmente en plantas e
invertebrados.

Blastómero de 4
células totipotentes
 Tipos de clonación

2.Clonación verdadera: Transferencia de núcleos de células de

individuos ya nacidos a óvulos o zigotos enucleados. Se originan
individuos casi idénticos entre sí (salvo mutaciones somáticas) y muy
parecidos al donante (del que se diferencian en mutaciones somáticas y
en el genoma mitocondrial, que procede del óvulo receptor).
 Clonación Reproductiva
Dolly fue desarrollada por Wilmut y colaboradores (Nature
385:810-813, 1997) en el Instituto Roslin de Edinburgo,
Escocia.
 Clonación Terapéutica y Células Madre

Fecundación in Clonación
vitro por
Células
Transferen
Madre
cia Nuclear
Embrionale
a Célula
s
Somática
Adulta

Células Indiferenciadas en Cultivo

Tejidos

Piel Hueso Nervioso Músculo

 Células Madre

También llamadas Troncales , Estaminales o

Stem Cells
Son Células capaces de:
• Generar como descendencia Células hijas especializadas
en algún tipo tisular
• Autorrenovarse en el tiempo
 Tipos
· Hay cuatro tipos:

· Totipotente: puede crecer y formar un

organismo completo, tanto los
componentes embrionarios como los
extraembrionarios.
· Pluripotente: no puede formar un
organismo completo, pero puede formar
cualquier otro tipo de célula proveniente
de los tres linajes embrionarios
(endodermo, ectodermo y mesodermo )
· Multipotentes: son aquellas que solo
pueden generar células de su propia
capa o linaje embrionario de origen.
· Unipotentes: pueden formar únicamente
un tipo de célula particular.
 Células Madre Adultas

Célula
HSC madre de la
Médula ósea
Precursores
del linaje
rojo
G.R.

Hematopoyesis Precursores
del linaje
G.B.
 Células Madre

Embrionales (ES)

Día 0 Día 3 Día 7

Fecundaci Trompas Previo a
onón Implantación
Embrión
m.c.i.

Trofoblasto
Zigoto Mórula Blastocisto Placenta
(óvulo fecundado) (varios Blastómeros) (masa celular interna) Son
Única Masa Masa Celular Células
Célula Celular Pluripotente Madre
Totipotente Totipotente Embrional
es in vitro
 Células Madre

Fuentes Proveedoras de Células Madre Adultas

Endotelio de
Córnea
Mioblastos Endotelio
Condroblastos Vascular
Osteoblastos Sistema
Nervioso
Estroma de Central
la Médula (SNC)
Ósea Cordón
(MSC) Umbilical
Hematopoyét
icas (HSC)
 Células Madre

Aplicación de las Células Madre Adultas para Terapias

Terapias Celulares

Reparación de Tejidos dañados

Tratamiento de enfermedades genéticas o

producidas por terapias oncológicas

 Linfomas
Leucemia
 Problemas inmunitarios
 Clonación

• Tipos de Clonación

• Fines teóricos

• Clonación Reproductiva

• Clonación Terapéutica
COMO FUNCIONA UN GENOMA?

GENÓMICA Y PROTEÓMICA
26 de junio del 2000: se concluyó
el proyecto del GENOMA HUMANO,
en el cual se invirtió más de 3.000 millones de dólares…..
EL
FUTURO......
Genómica y sociedad

Genómica y salud

Genómica biológica
MUCHAS GRACIAS!!!!!!!!!!!

vchambilla_64@hotmail.com