Mgr.

GIOVANNI ARAGON ALVARADO

 Composición y estructura de los ácidos
nucleicos.- Expresión de los genes. Síntesis
de DNA, RNA, Proteínas en procariotas y
eucariotas. Código genético. Mutaciones.
Mecanismos de reparación del DNA.
Recombinación. Tecnología de DNA
recombinante. Ingeniería genética.
Aplicaciones en la biotecnología. Problemas.
Composición
Composición yy Estructura
Estructura del
del
Material
Material Genético
Genético
 NUCLEÒSIDO

NUCLEÓTIDO
.-.-.-..
Reglas de Erwin Chargaff

Timo de becerro

Bazo de becerro

Levadura

Bacilo de la
Tuberculosis

1. Proporción de purinas = Proporción de pirimidinas

A+G=C+T

2. A=T

3. G=C
 1953. Año culminante:
J. Watson y F. Crick resuelven la
estructura tridimensional del DNA
(Nature 171: 737-738)

Watson y yo hemos
encontrado el
secreto de la vida
Significado de las reglas de Chargaff

Complementariedad de las bases

Interpretación del patrón difracción de rayos X del DNA

Rosalind E.
Franklin

Crick
Doble hélice, formada La estructura se mantiene
por cadenas orientadas gracias a enlaces de
en direcciones opuestas hidrógeno entre las bases
(antiparalelas). nitrogenadas que se
encuentran orientadas hacia
el interior de las cadenas
 Desnaturalización del DNA
Separación de las dos hebras por calor
•Una mayor proporción G-C tiene una mayor temperatura
de desnaturalización (‘fusión’)
100

80
Porcentaje G + C

60

40

20

70 80 90 100 110
Temperatura de fusión (desnaturalización)
Hélices levógiras y dextrógiras
DNA-B dextrógira
El DNA
contiene información
digital cuaternaria en
secuencias unidimensionales
de monómeros A,T,G,C
(cristal aperiódico)
 La estructura del DNA suministra una
explicación asombrosamente
simple del fenómeno de la herencia
La estructura explica:

• La naturaleza de la secuencia lineal de los genes

(información digital cuaternaria en secuencias
unidimensionales de monómeros A,T,G,C)
• El mecanismo de replicación exacta de los genes
• La naturaleza química de las mutaciones
• Por qué la mutación, la recombinación y la
expresión génica son fenómenos separables a nivel
molecular
 Esencial a la relación íntima
entre estructura molecular y
función genética del DNA es
el concepto de molde

La complementariedad de las bases

nitrogenadas permite que la
secuencia de una cadena sencilla de
DNA actúe como un molde para la
formación de una copia
complementaria de DNA
(replicación) o de mRNA
(transcripción)
 ESTRUCTURA
TRANSCRIPCIÓN TRADUCCIÓN

DNA RNA PROTEÍNA FUNCIÓN

REGULACIÓN

POST-TRADUCCIÓN

ALTERACIONES EN LA EXPRESIÓN DE LOS GENES PUEDE

OCURRIR EN CUALQUIER NIVEL
 Replicación del DNA
•Semiconservativa: una cadena sirve de molde para una
nueva cadena
•El experimento de M. Meselson y F. Stahl (1958)
demuestra que la replicación es semiconservativa

Mathew Meselson Frank Stahl

 Replicación del DNA
•Enzimas que sintetizan (replican) el DNA
•E. coli
•DNA polimerasa I (rellena huecos y repara)
•DNA polimerasa II y III (función principal en la
síntesis)
•Añade bases en ambas cadenas en la dirección
5’  3’
•Requiere un 3’ OH final
•Eucariotas
•5 polimerasas
 y  principal en replicación
,  y  exonucleasas
•Corrección de pruebas: actividad 3’  5’
exonucleotídica. Sustituye bases mal emparejadas
(10-5) por correctas (10-7)
 3’ 5’
Las polimerasas
conocidas añaden
nucleótidos
solamente en la
dirección 5’  3’
 Replicación del DNA
• Replicación: continua (cadena adelantada) y
discontinua (cadena retrasada)

•Discontinua
• Cebador (pequeño RNA 2-60 nucleótidos
añadido por enzima primasa o RNA pol que
provee 3’ OH)
• Fragmento de Okazaki por DNA pol III
(1500 bp en procariotas y 150 en
eucariotas)
• Pol I elimina cebador 3’ -> 5’ y llena huecos
(gap)
• Ligación (DNA ligasa, enlace fosfodiéster)
Polimerasa III

Polimerasa I
 Replicación del DNA
•Origen de replicación:
•Secuencia reconocida (Ori C en E. coli) por
proteínas iniciadoras. Varios orígenes en
eucariotas Horquilla
•La replicación es bidireccional replicación
En el modelo del círculo
rodador una endonucleasa
corta una de las hélices
(hélice externa en el
esquema) y el extremo 5' se
fija a la membrana. El
extremo 3'OH producido por
el corte lo utiliza la ADN
polimerasa como cebador
para ir añadiendo nucleótidos
y copiando la otra hélice
(hélice interna en el
esquema). Por el otro
extremo de la hélice cortada
(el extremo 5') también se va
sintetizando una nueva hebra.
 Replicación del DNA

El replisoma: complejo enzimático de la

replicación que coordina la síntesis de las dos
cadenas
•Primosoma: formado por dos enzimas
•Primasa
•Helicasa (desenreda el DNA)
•Proteína de unión a cadena sencilla, ssb (Unión
Y, estabiliza el DNA de cadena sencilla)
•Topoisomerasas tipo I y II -DNA ligasa-
(relajación del superenrollamiento)
En el DNA nuclear de eucariotas hay muchos orígenes
de replicación (~500 en levaduras y 60000 en
mamíferos). Cada unidad de replicación es un replicón.
La replicación es bidireccional
   ADN Pol I ADN Pol II ADN Pol III

     
Estructura 109.000 90.000 900.000
PM (dalton)
Constitución Monómero Monómero Multímero asimétrico
Nº Polimerasas/célula
400 Desconocido 10-20

Actividad/Función
   
Polimeras 5'-3'
SI SI SI
/Elongación
Exonucleasa 3'-
SI SI SI
5'/Correctora
Exonucleasa 5'-
SI NO NO
3'/Reparación
 ENZIMA FUNCIÓN

Síntesis Hélice retardada. Síntesis del

ADN Pol α cebador: 10 bases de ADN y 25 de
ARN.

ADN Pol δ Síntesis de la Hélice conductora.

Polimerización de las Piezas de

ADN Pol ε
Okazaki.

Unión de los fragmentos de Okazaki

ADN Pol β
( de aproximadamente 250 pb).

ADN Pol γ Síntesis ADN mitocondrial.

1-Reconocimiento del molde: unión de la RNA
polimerasa al DNA en la región del promotor.
La burbuja de transcripción se origina por
desenrollamiento iniciado en el sitio de unión de
la RNA polimerasa.
2-Iniciación: La enzima permanece en el
promotor mientras sintetiza los primeros nueve
enlaces, termina cuando la enzima comienza a
alargar la cadena y abandona el promotor.
3-Alargamiento de la cadena: la enzima se
mueve a lo largo del DNA y desenrolla la hélice
de DNA Los nucleótidos se añaden al extremo 3
´OH y se forma un híbrido DNA-RNA en la
región desenrollada.
4-Terminación: implica el reconocimiento del
punto que determina el final de la adición de
bases a la cadena. La secuencia de DNA
necesaria se denomina terminador.
 La RNA polimerasa de E.coli de 465 kDa holoenzima
con varias subunidades proteicas: Existen varios
tipos de factores sigma que reconocen tipos de
promotores diferentes relacionado con la regulación
de la transcripción, se identifican por su peso
molecular.
 Para las etapas de iniciación y
terminación se requieren de
unidades adicionales. Algunos
de estos polipéptidos pueden ser
requeridos por todos los genes,
otros solo son requeridos por
genes particulares; a estas unidades
se les conoce como factores de
control auxiliar.
SECUENCIAS DE CONSENSO propia de los sitios reguladores (promotores)
tanto en procarióticos como eucarióticos. En los promotores bacterianos se han
identificado tres elementos (para s 70): • Sitio de iniciación: generalmente una
purina. Es frecuente que sea la base central de la secuencia CAT.
• Secuencia -10 (caja TATA o secuencia Pribnow): de 6 bp en casi todos los
promotores. Permite al complejo la conversión de la forma cerrada a la abierta.
Que sea exclusivamente A-T facilita el proceso de fusión del DNA. La región de
fusión incluye el extremo derecho de la secuencia -10 y se extiende hasta justo
pasado el sitio de iniciación.
T80 A95 T45 A60 A50 T96 ( Cada subíndice indica el por ciento de aparición de la
base encontrada con mayor frecuencia).

• Secuencia -35: se encuentra a 35 bp corriente arriba del sitio de inicio. Su función

recae en proporcionar la señal para el reconocimiento por la RNA polimerasa
T82 T84 G78 A65 C54 A45
Transcripción en eucariotas
En las células eucariotas los genes nucleares son
transcritos por tres tipos de RNA polimerasas en
diferentes lugares específicos del núcleo. Son
proteínas grandes, como agregados de 500 kDa o
más con forma típica entre 8 y 14 subunidades.
Cada una reconoce promotores con características
específicas y el requerimiento en número y tipo de
factor de transcripción también es característico de
la enzima en cuestión. Las RNA polimerasas de
mitocondrias y cloroplastos son menores y se
asemejan más a la RNA polimerasa bacteriana.
 Interactúan: RNAm, RNAt, Ribosomas,
enzimas.
 Existen 31 tipos diferentes de ARNt: de 61
probables, sólo son 31.Unos pueden
reconocer a más de un codón.
 El codón de iniciación es el triplete AUG.
Existen 20 amínoacil – ARNt sintetasas
diferentes.
 La síntesis de las proteínas se divide en tres
etapas, llamadas de iniciación , de
alargamiento y de terminación
dihidrouridinas asa D.
La asa T, l trinucleótido
Ty C. La letra T
simboliza a la
ribotimidina y la y a la
seudouri dina.
REPLICACION DEL DNA

1) Ori (Origen de replicación): O

2) Term (Sitio de terminación): T
Ori

Ori
Virus
y
Bacterias

Ter
 REPLICACION DEL DNA

Telómero Telómero

T O T O T O T O T
Eucariotas
Replicón R R
Características:
1. Bidireccional
2. Hebra continua Hebra discontinua
3. Semiconservativa
4. Dirección 5’ 3’
5. DNA polimerasa I / II / II : procariotas
6. DNA polimerasa  /  / : eucariotas
7. Una batería de moléculas accesorias
8. Fases: Iniciación, Elongación,
Terminación
 REPLICACION DEL DNA

1. Iniciación

1) Dna A (Relaja)

B Helicasa (abre )
C

DNA B + C
SSB

J
SSB SSB B+C
K

SSB: Proteínas de unión a cadena SSB

sencilla (Single strand binding)
 REPLICACION DEL DNA

J
Primasa
K 5’ 3’ Dna G
(ARN pol)
B+C 3’ 5’
3’ 5’

Ojal de Replicación

2. Elongación

5’ 3’
GIRASA
5’ 3’ 5’
Topoisomerasa I
5’ 3’ Girasa
GIRASA
3’ 5’
 REPLICACION DEL DNA

DNA pol III + Dna G + Girasa

(Primasa) o ARN - pol - DNA
Dirigida o Iniciador (Primer)
+
Topoisomerasa I
Replisoma
3’
5’

3’ 3’

5’

5’
 REPLICACION DEL DNA

SSB Hebra continua

3’
DNA POL - III
5’
3’

5’ RNA RNA RNA

5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’
3’
5’
1000-2000 pb 1000-2000 pb

Hebra discontinua
 REPLICACION DEL DNA

DNA Pol III

RNA
(Nick translation)
Corta y cambia:RNA
por DNA
DNA POL - I
 REPLICACION DEL DNA

3. Terminación

DNA LIGASA
Dependiente de ATP
 ELONGACION DE LA TRANSCRIPCION
EN PROCARIOTES
a) INICIACION
+1

¡ P
¡
-35 P
P
-10
La subunidad (σ ) se disocia del promotor
nun

-10 P
b) ELONGACION 5´
P
P

5’ Movimiento de la enzima 3´
 OJAL DE LA TRANSCRIPCIÓN
EN PROCARIOTES
Movimiento de la enzima
5´ 3´
Cadena que codifica al DNA

Punto de enrollamiento Punto de desenrollamiento

Cadena molde de ADN

Sitio de unión al RNA Híbrido RNA-DNA

 ELONGACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN
EN PROCARIOTES

Burbuja de Transcripción
en la RNA polimerasa

Movimiento de la
5´ 3´ polimerasa

La cadena de RNA crece

 ASAS DE TERMINACIÓN DE LA
TRASCRIPCIÓN EN PROCARIOTES

Estructura secundaria

Región de unión
de
doble hélice

Unión en forma de asa Unión en forma de pinza

de cabello
 TRANSCRIPCION DEL DNA
EUCARIOTAS
citoplasma

Núcleo PROCARIOTAS
DNA Exón intrón

RNA Transcripción DNA

Transcripción
Empalme ARNm
RNA Traducción
Proteína

RNAm
Traducción

Proteína
 TRANSCRIPCION EN EUCARIOTAS

ADN

Transcripción

ARNhn inicial 5´ 3´
Clivaje inicial
Transcrito (ARNhn) 5´ 3´

polirribonucleotidil adenosin sintetasa

ARNhn - Poly A 5´
Fragmento 5´ Procesamiento
+
ARNhn - Poly A Nucleasas
7mG
ARNm - Poly A con Cap 7mG
+
Fragmentos 5´degradados 5´cap
QUE ES UN GEN INTERRUMPIDO?

Es una secuencia de “palabras” y sus

“silencios” o “espacios conectores”; escritas con un
alfabeto de solo cuatro letras A, T, C, y G y con los
cuales se “escribe” el mensaje cifrado de nuestra
herencia. Así, a cada palabra le llamamos EXON
(E) y a cada silencio le llamamos INTRON (I)

E I E I E I E

GEN
 QUE ES UN GEN?

E I E I E I E

VAMOS A LA CASA

ATCTCGGTTAAATGCGGTACAGGTATAGGACAG
A LA
BARAJAMIENTO (SPLICING) DIFERENCIAL DE EXONES

E1 I E2 I E3 I E4

VAMOS A LA CASA
E1 E2 E3

VAMOS A LA
E2 E3 E4

A LA CASA
E2 E4

A CASA
E1 E3

VAMOS LA
 TRADUCCION A PROTEINAS

Componentes de iniciación Subunidad ribosomal pequeño

(30s o 40s)

P A Subunidad ribosomal grande

Sitio P Sitio A (50s o 60s)

Subunidad Subunidad
AUG RNAm pequeña C AUG RNAm pequeña
30S 40S
IF1 IF2 IF3 Factores de iniciación 1a 2 3 4a 4b 5 Factores de iniciación

Subunidad Subunidad
grande grande
50S 60S

fMet – tRNA fMet GTP

fMet – tRNA fMet
GTP
fMet Met ATP
TRADUCCION A PROTEINAS 3’ RNA SINTETASA
A
A
C
Aminoácido
5’ C
G A Brazo aceptor
G C
G C
C U
mG G G
Asa D U U Asa TCG
G A U G C
D U G C G A G G C C U U A
C G
G G C G C U C C G G T  C
G D A
C G A C
U A G D
m2G C G G
C G
C G
U  ml
Asa anticodón U
I G C
Anticodón

C C G Codón
3’ 3 2 1 5’
RNAm
 TRADUCCION A PROTEINAS

AUG. CGU. AGA. GCU. UGA. GAU

Subunidad Grande RNA mensajero

Sitio aminocil N R C

Sitio peptidil R
N R R C
UCU UCU
Polipéptido
RNA de transferencia
Subunidad pequeña con y sin aminoácido

Ribosoma
N FC

INICIACION
UAC
Adaptado de Rothamsted Experimental Station,
1997,1998 AUG CGU AGA. GCU. UGA. G
 TRADUCCION A PROTEINAS

Paso No 1 de Elongación

A B
N
F C N F CN R C

UAC UAC GCA

AUG CGU AGA. GCU. UGA. AUG CGU AGA. GCU. UGA

Adaptado de Rothamsted Experimental Station, 1997,1998

 TRADUCCION A PROTEINAS

Paso No 2 de Elongación

C D
UAC
F R RC
N F RC N CN

GCA GCA UCU

AUG CGU AGA GCU. UGA. GAU AUG CGU AGA GCU . UGA. GAU

Adaptado de Rothamsted Experimental Station, 1997,1998

 TRADUCCION A PROTEINAS

Paso No 3 de Elongación

E F
GCA
GCA AC
N
F R R N
F R R A
N C
CN C

CGA
UCU UCU CGA
AUG. CGU AGA GCU UGA. GAU AUG. CGU AGA GCU UGA. GAU

Adaptado de Rothamsted Experimental Station, 1997,1998

 TRADUCCION A PROTEINAS

TERMINACION

N
F R R A
CN C

CGA
AUG. CGU AGA GCU UGA UUC. GAU

Adaptado de Rothamsted Experimental Station, 1997,1998

 TRADUCCION A PROTEINAS

Cadena de crecimiento aa1

aa2 aa3 Ribosoma
del polipéptido aa4
aa5 aa6 aa7

tRNA RNA4
Saliendo
CCC CAG
aa7 – tRNA7
RNAm llegando
U U U A G C

G G G A A A U C G G U C
Movimiento del ribosoma

Codon Codon Codon Codon Codon Codon Codon

aa1 aa2 aa3 aa4 aa5 aa6 aa7
RESUMEN DE LOS PROCESOS

(a) Transcripción
RNA

mRNA
Membrana
nuclear

Ribosoma mRNA

(b) Traducción
ES TODO POR
HOY
LODISH, H; Baltimore, y col. Molecular Cell Biology. Third Edition. Scientific
American Books New York, 1997.
LEWIN, Benjamin. Genes VII. International Student Edition. Oxford University.
Press, Inc. Nex York, 1999.
AYALA F. KIGER J. 1984. Genética moderna. Edit. Fondo educativo Interamericano
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GOODENNOUGH, Ursula 1981. Genética, Edit. Omega Barcelona.
GUIZAR – VASQUEZ, J. 1989. Genética clínica. Edit. El Manual Moderno S. A.
IZQUIERDO Rojo, Marta 1999. Ingeniería Genética y Transferencia génica.
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JENKINS, Jhon 1982. Genética. Edit. Reverte, Barcelona.
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