RECUENTO DE

BACTERIAS COLIFORMES
TOTALES

Norma Boliviana NB 32005

 Materiales
 Tubos de cultivo de 150 mm x 15 mm o 10
mm x 18mm
 Tubos Durham o de fermentación
 Frasco y tubos de dilución
 Gradilla para tubos
Aparatos
 Pipetas graduadas de 10 ml y 1 ml  Autoclave
 Asas de inoculación  Balanza digital
 Marcadores indelebles  Baños de agua, regulados a 44.5°C
 Propipetas  Refrigerador
 Homogenizadores stomacher o licuadora
 Phmetro
 Estufa de incubación reguladas a 35
 MEDIOS DE CULTIVO

Caldo laurilsulfato-triptosa
Composiscion  
Preparación
Triptosa 20 g
Disolver completamente la Lactosa 5g
sustancia, sin hacer hervir
enrasar a volumen con agua, Cloruro de sodi 5g
y distribuir a 10 ml en tubos Hidrogenofosfato de potasio 2.75 g
de cultivo que contengan
tubos durhan invertido Dihidrogeno fosfto ed potasio 2.75 g
esterilizar e autoclave Sulfato de sodio 0.1 g
durante 15 min a 121°C
Agua destilada 10 ml
 MEDIOS DE CULTIVO
Caldo verde brillante- bilis 2%
Preparación
Composición  
  Disolver completamente
la sustancia sin hacer Peptona 10 g
hervir enrasar a
Lactosa 10 g
volumen, tomar el ph 7.2
0.2 y distribuir a 10 ml Bilis de buey 20 g
en tubos de cultivo que
contengan tubos durham Verde brillante 0.0133g
invertidos esterilizar a
121°C durante 15 min Agua destilad 100000 ml
 “ TECNICA NUMERO MAS
PROBABLE NMP
”
Basado en la propiedad, que tienen los microorganismos denominados coliformes, de fermentar la
lactosa con producción de acido y gas a una temperatura entre 37° C e incubados durante un periodo
comprendido entre 24 a 48 h

consiste en un ensayo de dos fases :

 Prueba presuntiva
 Prueba confirmativa.
 TECNICA NUMERO MAS PROBABLE NMP
Prueba presuntiva
 Inocular
  9 tubos con caldo lauril sulfato- triptosa de
la siguiente manera  
3 tubos con 1 ml de la dilución 10-1
3 tubos con 1 ml de la dilución 10-1
3 tubos con 1 ml de la dilución 10-1
 Incubar a 35 2 °C durante 48 horas
 Observar la formación de gas en los tubos de
fermentación
 Anotar los tubos en los que se ve presencia de gas al
cabo de 24 h incubar los negativos 24 h adicionales
 La usencia de gas a las 48 h significa prueba
presuntiva negativa par coliformes
 Si existe formación de gas en los tubos registra el
numero de tubos positivos de cada dilución
 TECNICA NUMERO MAS PROBABLE NMP
Prueba confirmativa para
Coliformes Totales.

   cada uno de los tubos con Caldo lauril
De
sulfato que han producido gas, se
transfirió una azada en tubos de cultivo
con Caldo Verde Brillante Bilis, con tubos
Durham invertidos.
 Los tubos sembrados se incubaron a 35 °C
2°C por 24 horas a 48 horas
 La presencia de gas indica una prueba
positiva para coliformes .
 Se anota entonces el numero de tubos
cuya reacción es positiva
Prueba confirmativa para
Coliformes fecales
 De cada uno de los tubos con caldo lauril
sulfato que han producido gas se
transfiere un asda en tubos de caldo de
E.Coli con tubos Durham invertidos
atemperados previamente a 44.5 °C por
30min
 Los tubos sembrados se incubaron en baño
maria a 44.5 °C por 24 horas.
 La presencia de gas indica una prueba
positiva para coliformes fecales.
 Los datos obtenidos se expresaron en
número más probable (NMP) para tres
 “ TECNICA DE RECUENTO
DE PLACA
”
El método consiste en colocar 1 ml de alimento homogenizado al 10% y de las diluciones
 decimales a cajas Petri, en un medio selectivo. Después de una incubación de 48 h a 35 ºC 2
ºC se cuenta el numero de colonias características
Recuento de la bacteria
Escherichia coli en
(ufc/mL)
 MEDIOS DE CULTIVO
Caldo E.Coli EC
Composición  
Preparación
 Disolver Triptona 20 g
completamente la
sustancia, sin hacer hervir Lactosa 5g
ensarar a volumen con
Mezcla de sales biliares 1.5g
agua, ajustar el pH a 6.9,
distribuir a 10 ml en tubos Hidrogenofofato dipotasico 4g
de cultivo que contenga
Dihidrogenofosfato potásico 1.5 g
tubos Durham invertidos y
esterilizar en autoclave Cloruro de sodio 5g
durante 15 min a 121 °C
Agua destilada 100000ml
 MEDIOS DE CULTIVO
Agar Mac Conkey
Composición  
Preparación
Proteosa peptona o polipepton 3g
 Suspender los componentes y calentar
con suave agitación hasta disolver, Peptona 17 g
esterilizar en autoclave a 121 °C
durante 15 minutos. Enfriar entre 45- Lactosa 10 g
50°C y fraccioner 20 ml en placas prtri
estriles Sales biliares 1.5 g
 De cada tubo que contiene Caldo E.Coli Cloruro de sodio 5g
ECcon formación de gas, se transfirió
una porción con el asa de inoculación y Rojo neutro 0.03 g
se sembró sobre la superficie del Agar
Mac Conkey en cajas petris. Este medio Cristal violeta 0.001 g
de cultivo es esencial para el
crecimiento de la bacteria Escherichia Agar 13.5 g
coli. Agua destilada 1000 ml
 Recuento de la bacteria
Escherichia coli
 Se incubo las cajas a 37° C por un periodo de 18
a 24 h.
 Posteriormente se realizo el recuento de la
bacteria Escherichia coli.
 Se procedió a identificar mediante Tinción
Gram.
 Los datos obtenidos se expresaron con un solo
número entero y un decimal por diez elevado a
la potencia correspondiente.
Presencia de la bacteria
Estaphylococcus aureus
en ufc/mL
 MEDIOS DE CULTIVO
Agar base sangre
Preparación
 Disolver los componnts en agua, calentar agitando suavemnet
hasta llevar a ebullición durante 1 minuto. Llenar 173 de
tubos de ensayo de 16x150 mm, tapar y esterilizar a 121 °C Composición  
durante 15 minutos. Entes de solidificar inclinar los tubos
para obtener un pico de flauta de 4-5 cm y n fodo de 2-3 mm Triptosa 10 g
 De acuerdo al Norma Boliviana NB 32004, el método consiste
Extracro de carne 3g
en extender un volumen determinado de las diluciones
correspondientes de la leche homogeneizado, sobre la Cloruro de sodio 5g
superficie de Agar Base Sangre, en este medio de cultivo se
forman colonias negras rodeadas de zonas claras Agar 15 g
características de Staphylococcus aureus este método utiliza
la prueba de coagulasa y catalasa. Agua destilada 1000 ml
 Recuento en placa
 Colocar en la autoclave todos los materiales de vidrio y medios de cultivo para
esterilizar.
 Se peso el medio de cultivo Agar Base Sangre en una balanza de precisión y luego
se vertió en un vaso Erlenmeyer, luego se añadió agua destilada hasta que se
disuelva.
 Se preparó las diluciones para cada muestra 1 en 10; 1 en 100; 1 en 1000.
 El método de siembra que se utilizo es por estría. El cual consiste en sembrar
sobre el Agar.
 Se incubo a 37 ºC durante 24 h.
 Observar después de 48 h la formación de colonias.
 Posteriormente se realizo el recuento de colonias sospechosas de Estaphylococcus
aureus.
 Se realizo la identificación mediante Tinción Gram donde se observaron al
microscopio cocos Gram positivos y en racimos
 Prueba de Coagulasa y
Catalasa para la bacteria
Estaphylococcus aureus
 Características de la bacteria
Estaphylococcus aureus
 Gram positivo en racimo.
 Aproximadamente 1um de diámetro.
 Inmóviles.
 No forman esporas. 40
 La mayoría son anaerobios facultativos
 Crece bien en Agar Sangre a 37°C.
 Presenta un pigmento de color amarillo.
 Catalasa positivo.
 Coagulasa positivo.
 Colonias medianas, cremosas y brillantes
 Prueba de Coagulasa y Catalasa para la bacteria Estaphylococcus
aureus
Prueba de Catalasa
 Consiste en realizar una
catalasa, que dará positivo,
por la presencia de esta
enzima en Staphylococcus
spp, que desdobla el
peróxido de hidrógeno en
agua y oxígeno
(desprendimiento de
burbujas) y esta prueba nos
ayuda a diferenciar de los
Streptococcus spp.
Prueba de Coagulasa
 Para la detección de Staphylococcus
aureus se requiere realizar la prueba de la
coagulasa que nos permite diferenciar al
S.aureus de otras especies del género
Staphylococcus. La coagulasa es una
enzima que estimula la conversión del
fibrinógeno en fibrina, por lo que
comprueba la facultad de un
microorganismo de coagular el plasma por
acción de esta enzima. Si es coagulasa
positivo, se produce una turbidez
alrededor de la colonia, debida a la
coagulación del plasma.