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INTEGRANTES:
JOEL FREIRE
STEEVEN BOSQUEZ
RONALD PIGUAVE
LUIS ROJAS
BYRON CARVAJAL
DOCENTE:
Ing. ORLY CEVALLOS
ASIGNATURA:
BIOLOGIA MOLECULAR
CURSO:
CUARTO “A”
AÑO LECTIVO:
2017-2018
INTRODUCCION
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El primer paso en cualquier protocolo de separación es el rompimiento del
material inicial, ya sea de origen viral, bacteriano, vegetal o animal. El
método utilizado para romper la célula debe ser tan leve como sea posible
con el fin de causar el menor daño posible al ADN. La lisis celular se puede
hacer por acción mecánica, pulverizando el tejido con hielo seco o nitrógeno
líquido, también se puede utilizar la degradación enzimática de la pared
celular (si está presente) y lisis con detergentes de las membranas celulares.
Seguido al rompimiento celular la mayoría de métodos involucran una
desproteinización, lo cual se lleva a cabo con un solvente orgánico, seguido
de una precipitación con isopropanol o etanol y posterior solubilización con
agua o tampón.
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METODO DE SALTING-OUT
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PREPARACION DE REACTIVOS
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PREPARACION DE REACTIVOS
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PREPARACION DE REACTIVOS
· Solución de rehidratación 10 ml :
TE Preparar :
TRIS 1 M pH 8.0 100ml PM 121.1g
EDTA 0.5 M pH 8.0 100ml
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PROCEDIMIENTO
1. En un tubo de 15 mL, medir 8 mL de Buffer de lisis de glóbulos
rojos y sobre este adicionar con una pipeta de Pasteur 2 mL de
sangre total. Con la misma pipeta mezclar muy bien y con mucha
suavidad hasta lograr una completa homogenización.
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PROCEDIMIENTO
2. Por inversión agitar muy suavemente durante 7 minutos a
temperatura ambiente.
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PROCEDIMIENTO
4. Descartar el sobrenadante y conservar el pellet.
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PROCEDIMIENTO
6. Adicionar 2.5 ml de Buffer de lisis celular y mezclar varias veces,
hasta homogenizar. Dejar al menos 20 minutos a temperatura
ambiente. (En este paso se puede suspender el procedimiento,
incluso hasta el día siguiente, dejando los tubos a 4ºC).
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PROCEDIMIENTO
7. Adicionar 800 μl de solución precipitante de proteínas. Mezclar
fuerte, hasta observar grumos de las proteínas precipitadas.
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PROCEDIMIENTO
9. Verter todo el sobrenadante sobre un tubo de 15 mL que contenga
2,4 Ml de isopropanol frío (alcohol isopropílico), dejar en reposo al
menos unos 5 minutos.
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PROCEDIMIENTO
11. Envolver el ADN en una pipeta y pasarlo rápidamente por etanol
al 70% frío, dejar secar a temperatura ambiente y resuspender
finalmente en buffer TE (Tris-HCL 10 mM EDTA 1mM) de 50-500
μl, dependiendo de la cantidad de ADN recuperado. Nota: El ADN
se puede recuperar tomándolo con pipeta Pasteur y centrifugando a
10.000 rpm por 5 min y lavar con 200 μl etanol al 70%.
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