MICROBIOLOGIA DE LAS FERMENTACIONES VÍNICAS La Mirobiología es una de las técnicas más antiguas con las que cuenta la Biotecnología, cuyo remoto origen en la práctica va en forma paralela a la elaboración de bebidas alcohólicas, así el vino cuya historia se confunde con la leyenda y la mitología, talvez originaria del Asia Menor, deJapón o de Egipto, alcanzando su máximo esplendor en la ribera del Mediterraneo. LA ENOLOGÍA COMO CIENCIA Nace con los primeros descubrimientos del mundo microbiano, mérito que se atribuye a Leeuwehoeck, dos siglos más tarde Desmazieres confirma los descubrimientos del holandes. Luis Paster a mediados del siglo XIX, desentraña una serie de problemas en torno a las transformaciones de la materia orgánica por la activa participación de los microorganismos, el danes Hansen establece los fundamentos del aislamiento y de la taxonomía. La citología de los organísmos celulares es descrita por Guilermond y finalmente Winge se introduce en el campo genético de las levaduras. FERMENTACIONES ESPONTÁNEAS Las publicaciones de los citados hombres de ciencia y otros connotados microbiológos del siglo XX como Muller-Thurgau, Gino de Rossi-Castelli e Iñigo ponen en evidencia varios hechos importantes: •En la fermentación espontánea de mostos de frutas se perfilan dos etapas biologícamente diferenciadas, una fermentativa y otra aerobia. •En la etapa fermentativa participan más de dos especies, que lo hacen escalonadamente sucediéndose en tres períodos o fases. •En la etapa aerobia aparecen velos blastomicéticos sobre el producto final una vez terminada la fermentación. Se publica la distribución ecológica de levaduras y bacterias para las diferentes zonas geográficas de Italia, Francia y España. FERMENTACIONES ESPONTÁNEAS En cada zona queda establecida una frecuencia de participación de las especies de levaduras fermentativas y aeróbicas. El mosto en su transformación espontánea a vino lo hace a través de un proceso fermentativo en el que se suceden tres fases perfectamente diferenciadas y una etapa aerobia, al témino de la fermentación, en cada fase intervienen levaduras con marcadas diferencias fisiológicas y modelos fermentativos: Homoláticos, Heteroláticos e incluso modelos respiratorios estrictos. Cada especie cumple funciones específicas de tranformación selectiva. FERMENTACIONES ESPONTÁNEAS
Las conclusiones más significativas en relación con la
ecología y la actividad fermentativa de las levaduras en los mostos de uva son: • En la primera fase predominan levaduras apiculadas las cuales producen bajo grado alcohólico y concentraciones apreciables de ácidos volátiles. Algunas esporuladas y otras no, predomina hasta el tercer día. FERMENTACIONES ESPONTÁNEAS
En la segunda fase predominan levaduras de forma
redonda y esporuladas, especies de gran pureza fermentativa, productoras de grado alcohólico medio, concentraciones apreciables de metabolitos secundarios como ácidos orgánicos, aldehídos y ésteres, estas predominan entre el 3ro y 4to día. FERMENTACIONES ESPONTÁNEAS
La tercera fase está controlada por las diferentes
especies del género saccharomyces típicamente alcohóligenas, que terminan el proceso fermentativo con el total agotamiento de los azúcares, son levauras de forma elíptica, esporuladas, reproducción unipolar de dimensiones mayores que las anteriores, soporta concentraciones de etanol hasta de 19 °GL, producen bajas concentraciones ácido acético y otros metabolitos secundarios. Predominan entre el 5to y 10mo día FERMENTACIONES ESPONTÁNEAS
La aparicón de velo blastomicético una vez trancuridos
unos 15-20 días se produce en la totalidad de las muestras procedentes de climas templados a cálidos y un porcentaje menor en muestras procedentes de climas fríos. Dicho velo estan constituidos por especies de levaduras del género saccharomyces si el grado alchólico es superior a 13° GL y estas mismas y otras de los Géneros Hansénula, Zygosacharomyces, Candida Rhdutola y Pichia, si el grado alchólico es superior a 13° GL ESPECIES MAS FRECUENTES EN LAS DIFERENTES FASES K. apiculata, 1ra Fase C. pulcherrima H. guillermondi Z. Veronae 2da Fase T. Rosei T. vacillaris S. ellipsoideus S. pastorianos 3ra Fase S. ubaru S. oviformis S. Beticus Etapa Aerobia S. Cheresiensis H. anomala AISLAMIENTO DE CEPAS DE LEVADURA
El aislamiento de levaduras a partir de mostos en
fermentación espontánea se realiza en diferentes períodos (3er día, 5to día, 7mo día y 20mo día). Con el objetivo de obtener cultivos puros de levaduras de las diferentes etapas y fases fermentativas, de cada etapa se aislan como mínimo 10 cultivos puros. Para aislar las mustras se siembran por versación y extensión en placas petri. Los medios de cultivo utilizados son: Agar-Elliker y para bacterias Agar-Rogosa. El medio de cultivo natural para el aislamiento y conservación es agar-malta con una pequeña dosis de antibíotico,el que se ha solidificado en tubos de ensayo en forma de pico de flauta. IDENTIFIACIÓN Y CLASIFICACIÓN DE ESPECIES DE LEVADURAS Se utilizan los métodos y técnicas propuestos por Kreger-van-Rig con ligeras modificaciones debidas a la Escuela Enológica de Perugia. Las principales características son: •Morfológicas: Examen microscópico, exámen de ramificaciones pseudomiceliares, formación de esporas y tipos e reproducción. •Fisilógicas: Asimiliación de nitratos, azúcares, escisión de arbutina , fermentación de azúcares, poder fermentativo y formación de velo. SELECCIÓN DE LEVADURAS Los criterios tecnológicos de selección para conseguir productos de fermentación tipificados con escasas o nulas variaciones de unos años a otros se basan en: •Tiempos de adaptación y tiempo de crecimiento exponecial. •Poder fermentativo •Acides volatil •Biosíntesis de alcohóles superiores y ésteres Las levaduras seleccionadas preferntemente son autóctonas de la microflora epifítica de las propias regiones donde se realizará la fermentación.(levadura localmente seleccionada) CONSERVACION DE LEVADURAS Las levaduras seleccionadas son conservadas en bancos de cepas de levadura, las formas de conservación son: 1.Liofilizadas 2.En tubos de ensayo conmedio en pico de flauta conservada 3.Por secado spray y envasado al vacío en atmósfera inerte Todas las formas requieren ser conservadas en refrigerador a 4°C, en general son conservadas por duplicado, una de las muestras se utilizará para la manupulación y la otra únicamenete para la reproducción y conservación posterior TIPOS DE FERMENTACIÓN Tipos de cultivo en la fermentación alcoholica: • Fermentación convencional dirigida por especies de la flora epifítica seleccionadas por la adición de SO2. •Fermentación convencional dirigida por una especie del genero Sacharomyces, sembrada en mostos esteriles. •Fermentación convencional dirigida por una especie del genero Sacharomyces y la flora epifítica. •Fermentación multiple secuencial dirigida por una asociación de levaduras localmente seleccionadas. •Ferementación Multiple secuencial dirigida por una asociación de levaduras seleccionadas por el grado alcohólico R4. CONDICIONES DE FERMENTACION Los parámetros de control en la fermentación alcohólica son: • Concentración de azúcar ( 6.6 < Ca < 23 Brix) • Relación carbono nitrógeno ( C/N = 22) • Temperatura ( 8 °C < T < 25) • pH ( 4.5 < pH < 5.5) • Agitación al principio para airear al mosto y esporádicamente para mejorar la extracción • Presión (P < 1.5 atm). • Acidez volatil < 0.75 gr/l de acido acético • Tiempo de fermentación 7 a 10 días Producción de singani ecológico en la Bodega de San Pedro •Denominación de origen (Uvas varietales y Cepas de levadura) •Aislamiento de Cepas de levaduras nativas del biotopo natual de Cinti 1994 •Fermentación espontanea de mostos varietales •Aislamiento de 105 cultivos puros de fases diferentes •Determinación de características morfológicas y fisiológicas SELECCIÓN DE CEPAS DE LEVADURAS •Morfología de las cepas puras •Cinetica de fermentaciones (determinación de tiempos de adaptación y crecimiento exponencial) •Pruebas de poder Fermentativo •Producción de Ac. Volatil •Producción de alcoholes superiores •Producción de esteres totales •Producción de polialcoholes FERMENTACIONES A ESCALA DE PLANTA PILOTO •Mosto de uva de la variedad Moscatel de alejandria •Cepas seleccionadas de alto y medio poder fermentativo •Aplicación del diseño factorial en la planificación experimental •Fermentación múltiple secuencial, dirigida por asociaciones de cepas selecionadas en fermentadores de 2000 litros •Estabilización y destilación convencional •Análisis fisicoquímico y análisis sensorial ESTABILIDAD MICROBIOLÓGICA La estabilidad microbiológica del vino depende de los factores: • Tipo de fermentación • Concentración de azúcares residuales • Grado alcoholico • Concentración de SO2 libre • Concentración polifenoles totales • Concentración de CO2 • pH • Concentración de aditivos SO2, Ac. Sorbico, Ac. benzoico y Ac cítrico.