32 - Enzimi e cellule immobilizzati

Problemi relativi all’uso di enzimi solubili in applicazioni industriali:

 
• Costi di estrazione e purificazione
• Instabilità delle preparazione
• Difficoltà di recupero dopo la reazione
 
Vantaggi delle tecniche di immobilizzazione degli enzimi:
 
• Riutilizzabilità per reazioni successive
• Applicabilità di processi in continuo
• Facilità di separazione del prodotto
• Facilità di manipolazione
• In alcuni casi miglioramento delle caratteristiche (attività e stabilità)
 
Casi in cui conviene usare cellule intere invece di enzimi:
 
• Enzimi intracellulari: l’estrazione può non essere economicamente vantaggiosa
• Trasformazioni multienzimatiche: le cellule hanno già tutti gli enzimi necessari
• Trasformazioni che necessitano cofattori, es coenzimi, ATP, etc: già disponibili
nelle cellule intere
DEFINIZIONE di enzima immobilizzato (EI):

1. fisicamente CONFINATO
2. attivo
3. utilizzabile più volte
4. utilizzabile in continuo
 
Gli EI si possono dividere in tre categorie:
 
5. Enzimi modificati in forme non solubili in acqua
6. Enzimi solubili confinati in membrane selettivamente permeabili
7. Enzimi (solubili) a mobilità ridotta per legame/interazione con altre
macromolecole (che vengono definite il ‘supporto’)
Caratteristiche dei SUPPORTI per EI:
 
• Superficie elevata (estesa interazione con gli enzimi)
• Permeabilità e idrofilicità (interazione col solvente e i reagenti)
• Insolubilità (facile recupero del catalizzatore)
• Stabilità meccanica termica e chimica (resistenza ai trattamenti)
• Resistenza ai microbi (non biodegradabile, stabilità)
• Rigenerabile (recupero del supporto per altri carichi enzimatici)
• Formabilità di particelle (facilità di manipolazione)
MORFOLOGIA del supporto:
 
Non Porosi: svantaggi = basso rapporto area/volume  ridotta capacità di carico
dell’enzima. Vantaggi = limiti di diffusione dei reagenti ridotti

Porosi: svantaggi = problemi di diffusione dei reagenti. Vantaggi = alta capacità di

carico per l’elevato rapporto area/volume

E E
E E E
E E
E E E E
non
poroso E
E E E
E poroso
E E
E E
E E
E
E E
E E
E

Figura 32.0.1 - Supporti porosi e non porosi. Gli ovali rappresentano le molecole enzimatiche legate alla superficie del
supporto (in azzurro). Substrati e prodotti sono rappresentati dai circoletti blu e rossi, rispettivamente. E’ evidenziata la
reazione di una molecola di enzima (in arancione) sulla superficie di un supporto non poroso (a sinistra) e all’interno di
un poro (a destra), nel quale si accumula il prodotto a causa della resistenza del poro stesso al trasferimento di massa
(frecce blu e rossa) di substrato e prodotto. L’accumulo del prodotto influenza negativamente l’equilibrio di reazione.
CLASSIFICAZIONE DEI SUPPORTI
 
I supporti possono essere di natura organica o inorganica:

• Inorganici
• Minerali (bentonite, pomice)
• Vetrosi (ceramica, vetro, silice)
• Organici
• Polimeri naturali (cellulosa, amido, destrano, agar/agarosio, alginato,
carragenano, chitina)
• Proteine (collagene, gelatina, albumina, seta)
• Polimeri sintetici (polistirene, poliacrilati)
• Carbone attivo
Cellulosa (glucosio 1-4) funzionalizzata:
• (AE) aminoetil-cellulosa
• (DEAE) dietilaminoetil-cellulosa
• (CM) carbossimetil-cellulosa
Destrano (glucosio 1-6):
(Sephadex = crosslinked)

CH2
O
OH
O
OH
OH
CH2 CH2
(1-6)
O O
OH OH
O O
OH OH
OH
CH2
O
(1-4)
OH
O
OH
OH

Figura 32.0.2 - Struttura del destrano.

Polimeri estratti da alghe:

• Agarosio (polimero del galattosio; gelifica a bassa temperatura)

• Alginato (polimero di acidi guluronico e mannuronico; gelifica in presenza di Ca 2+
formando un reticolo ionico con i gruppi –COOH)
• Carragenano (polimero del galattosio 2 o 4 solfato con gruppi funzionali [-OSO 3H]
acidi; gelifica in presenza di controioni come l’alginato)

CH2OH O CH2OH O
OH OH
O CH2 O CH2
O O
HO HO
O 14 O O 14 O O

OH 13 OH

Figura 32.0.3 - Struttura dell’agarosio.

L’ agarosio è un polimero lineare (PM circa 120.000) costituito da unità (13)
- b-D-galattopiranosio - (14) - 3,6-anidro-a-L-galattopiranosio.
 COOH COOH COOH
poli M
O O O
O OH OH O OH OH O OH OH O

O O O poli G
COOH COOH COOH
O OH OH O OH OH O OH OH O

COOH COOH
O O poli MG
O O
COOH COOH
OH OH OH OH O
O OH OH O O OH OH O

Figura 32.0.4 - Struttura dell’alginato. G = acido guluronico, M = acido mannuronico.

Il Carrageenano consiste di unità alternate (1-4) b-D-galattopiranosio
e (1-3) -D-galattopiranosio.
POLIMERI SINTETICI

Polistirene: è stato il primo polimero utilizzato per EI, ma è idrofobico e quindi

non utilizzabile vantaggiosamente (stirene C6H5CH=CH2)
 
Poliacrilati: es poliacrilammide (acrilamide CH2=CHCONH2, reticolata con bis-
acrilamide (CH2=CHCONH)2CH2; la reazione di polimerizzazione è di tipo
radicalico)

-
CH2=CHCONH2 + SO4 • + X X-CH2-CH-CONH2
acrilammide persolfato (temed) •

CONH2
X-(CH2-CH)n-CH2-CH-CONH2 n CH2=CHCONH2
•

CONH2
X-(CH2-CH)n-CH2-CH-CONH2
(CH2=CHCONH)2CH2
bis-acrilammide
CH2-CHCONH
•
CH2

CONH2 CH2-CHCONH
•
X-(CH2-CH)n-CH2-CH-CONH2

2-
Figura 32.0.5 - Polimerizzazione dell’acrilammide. Il persolfato (perossido del solfato, S2O8 ) genera il radicale che attiva
il temed (N,N,N’,N’ tetrametil etilendiammina) il quale a sua volta innesca la reazione di polimerizzazione radicalica
dell’acrilammide. I punti di ramificazione sono quelli costituiti dalla bis-acrilammide, su cui possono innestarsi due catene
polimeriche nascenti.
32.1 - Sistemi di immobilizzazione

Enzimi solubili
Intrappolamento in membrane
Intrappolamento in fibre cave
 
Enzimi insolubili
Intrappolamento
Gel
Fibre
Microincapsulazione
Legame a supporto
Crosslinking
Adsorbimento fisico
Legame ionico
Legame con metalli
Legame covalente
I metodi più utilizzati sono la reticolazione o crosslinking, il legame al supporto e
l’intrappolamento.

CROSSLINKING. Le molecole enzimatiche in forma solubile vengono messe a

contatto con l’agente reticolante, si forma una rete di molecole legate tra di loro
col reticolante. La ‘rete’ diventa insolubile e precipita.

L’agente reticolante più comune è la glutaraldeide: CHO – (CH2)3 – CHO

I gruppi reattivi con i terminali aldeidici sono i gruppi – NH 2 (ad esempio della
lisina). Il legame che si forma (base di Schiff) è stabile al pH, alla temperatura e
irreversibile in condizioni operative:

Enz – N=CH– (CH2)3 – CH=N – Enz

E E
E E
E
E E E
E E
E
E E E

Figura 32.1.1 - Metodo di crosslinking per l’immobilizzazione di molecole proteiche. I simboli a manubrio rappresentano
le molecole bifunzionali che reagiscono con le molecole enzimatiche (ovali gialli) producendo un reticolo insolubile.
LEGAME AL SUPPORTO. L’interazione tra l’enzima e il supporto può essere di varia
natura, a seconda del tipo di supporto utilizzato.

• Adsorbimento (legami deboli e reversibili, Van der Waals, interazioni dipolari,

legami idrogeno; es invertasi su idrossido di alluminio nel 1916)

• Legami ionici, più forti ma sempre reversibili agendo su pH e forza ionica (es
cellulosa e destrani funzionalizzati)

• Legami con metalli (metalli di transizione come titanio e zirconio complessano

ligandi di origine proteica: - OH, - NH2, - SH)

• Legami covalenti, sono stabili e forti ma si ottengono in condizioni di reazione

molto spinte che possono danneggiare l’enzima. Vedi ad esempio polisaccaridi
funzionalizzati con gruppi reattivi. E’ necessario proteggere il sito attivo
(reazione in presenza del substrato). I gruppi funzionali proteici più reattivi
sono - OH, - NH2, - SH, - COOH)
 + -

O
R H
- + - +
+ O

R H
- +

Figura 32.1.2- Tipi di legame di adsorbimento al supporto. A sinistra le interazioni di Van der waals tra le nuvole
elettroniche esterne (frazioni di carica oscillanti), al centro le interazioni elettrostatiche dipolo-dipolo (frazioni di carica
stabili) e a destra i legami idrogeno tra l’idrogeno ossidrilico e i doppietti elettronici.
- OH
INTRAPPOLAMENTO. L’unica interazione con l’enzima è un confinamento fisico.
Si può ottenere per polimerizzazione di monomeri in presenza dell’enzima (es
poliacrilammide) o tramite polimeri preformati, come la gelazione ionotropica
di alginati o carragenani in presenza di controioni: le molecole enzimatiche,
presente nella miscela di gelazione, rimangono intrappolate nel reticolo.

soluzione gel I gel II

Figura 32.1.3 - Meccanismo della gelazione ionotropica. Le molecole libere in soluzione vengono coordinate
dall’aggiunta dello ione (in arancione). Ulteriori aggiunte di ione generano strutture di gel più resistenti, aumentando
l’ordine delle fibre.
 soluzione gel I gel II

Figura 32.1.4 - Meccanismo della gelazione termica. Con l’abbassamento della temperatura i filamenti di polimero in
soluzione si associano in strutture ordinate generando il gel. Abbassando ulteriormente la temperatura o allungando i
tempi, le strutture si consolidano diventando più compatte e/o reclutando altri filamenti. Il gel diventa più resistente.
 E
E
E
E
E
E
E
E E
E
E E

Figura 32.1.5 - Intrappolamento di molecole enzimatiche (in azzurro) nel reticolo di gel di agarosio.
CINETICA ENZIMATICA
 
Si possono avere delle apprezzabili differenze nei valori caratteristici degli enzimi di Km e Vmax.
Le variazioni possono essere dovute a:
 
• Effetti conformazionali o sterici che alterano la forma dell’enzima a causa dell’interazione
con la matrice

• Effetti di ripartizione o diffusione dei reagenti o dei prodotti tra l’ambiente di reazione
(bulk) ed eventuali microambienti in prossimità o all’interno della matrice. Queste
differenze possono essere dovute sia all’attrazione/repulsione dei reagenti/prodotti da
parte della superficie della matrice (es superficie carica o polare, reagenti carichi o polari,
etc), sia ad impedimenti di tipo fisico al trasferimento di massa (maglie del reticolo della
matrice particolarmente strette, substrati viscosi, etc)
 
Variazione del pH di massima attività (es se la superficie della matrice è carica si ha una
diversa distribuzione di ioni OH-/H+ tra il bulk e la matrice)
 
Variazione della temperatura di massima attività (es in seguito a delle variazioni
conformazionali dell’enzima)
 
Variazione della stabilità termica (es resistenza maggiore alle variazioni conformazionali che
portano alla denaturazione)
 Supporto

E
Affinità per
il prodotto

Affinità per
E
il substrato

Affinità per -
il protone - H+ H+
E H+ Ambiente
- di reazione
- H+
+
H
H+

Figura 32.1.6 - Effetti della matrice sui parametri biochimici dell’enzima immobilizzato. In alto il caso di affinità della
matrice (elemento a strisce rosse) col prodotto (dischetti rossi). Al centro, affinità della matrice (elemento a strisce blu)
con il substrato (dischetti blu). Substrato e prodotto si distribuiscono in modo differenziale tra l’ambiente di reazione e la
prossimità dell’enzima (in giallo) alla superficie della matrice. In basso il caso di una matrice con carica netta negativa,
che genera un gradiente di pH tra matrice e ambiente di reazione.
 Perché usare dei processi enzimatici:
• Un prodotto nuovo ed utile
• Un prodotto di qualità migliore
• Un prodotto a costo più basso

Enzimi utilizzati nell’industria alimentare, industria dell’amido, detergenti,

catalizzatori chimici in processi industriali etc

Enzimi solubili Enzimi immobilizzati

•Costo •Riutilizzabile
•Difficoltà e costi di •Facilmente separabile dal
preparazione prodotto
•Impossibilità di riuso •Spesso più stabile
•Instabilità
USO INDUSTRIALE degli ENZIMI IMMOBILIZZATI

Finora limitato principalmente alle applicazioni alimentari e farmaceutiche.

Uso limitato dalla quantità relativamente bassa (per un uso su scale industriale) di
enzima che si riesce a produrre ed al suo costo.

Prevedibile un uso industriale di Enzimi quando:

• prodotto ottenibile solo per via enzimatica
• costi troppo elevati per altra via

Processi industriali attuali con Enzimi immobilizzati:

• Produzione di sciroppo di fruttosio (glucosio isomerasi)
• Risoluzione ottica di aminoacidi (aminoacilasi)
• Produzione di D-aminoacidi (idantoinasi)
• Produzione acido aspartico (aspartasi)
• Produzione di acido malico (fumarasi)
• Deacilazione penicilline e cefalosporine (penicillina amidasi)
• Idrolisi lattosio (lattasi)
• Produzione sciroppo di glucosio (invertasi)
• (produzione di glucosio da amido idrolizzato (glucoamilasi))
Sciroppo di fruttosio da mais (HCFS: high-fructose corn syrup)

•Processo industriale più importante

•Sviluppato nei paesi temperati con abbondanza di materiali amidacei
•Preparati commerciali di Glucosio isomerasi immobilizzata principalmente per
adsorbimento, crosslinking, intrappolamento o intrappolamento cellule intere.
•Organismo fonte di enzima: Streptomyces sp

Prodotto Potere dolcificante

Saccarosio 100
Glucosio 75
Fruttosio 165
HFCS (42%) 100
Maltosio 30-50
Lattosio 20
Tabella 32.2.3 - Potere dolcificante degli zuccheri. Il saccarosio è preso come valore di riferimento (100).

USO del HFCS: Confronto HFCS con saccarosio:

•Bevande non alcoliche •Stesso potere dolcificante

•Dolci •Prodotto a costo più basso
•Prodotti da forno •Più rinfrescante del saccarosio
•Scatolame •Basso rischio per diabetici
•Prodotti confezionati
 Sospensione amido Glucosio
isomerasi
immoblizzata
 (endo) amilasi batterica
Ca(OH)2
pH 6-7, 80-100°C, 2-4 h
Mg+2, pH 8.5
Concentrazione Fruttosio 43% + glucosio 51%
Idrolisi amido Deionizzazione
Decolorazione Carboni attivi
Deionizzazione
Glucoamilasi fungina Concentrazione
pH 4-5, 60°C, 1-4 giorni Arricchimento in fruttosio

Saccarificazione (>95%) amido Prodotto finale

Figura 32.2.1 - Diagramma della preparazione dello sciroppo di fruttosio.

IMPIANTI UTILIZZATI per la GI immobilizzata:
IN
•Discontinuo S
•Continuo letto-impaccato
•Continuo stirred-tank
•A ricircolo Cellule F S+P
•Tubolari con pareti attive immobilizzate

Il più usato è il continuo a letto impaccato,

OUT
P
eventualmente con ricircolo.

Confronto dei costi

Batch, enz. solubile Continuo, enz. imm.
Tempi di processo 20 ore 30 giorni
Costi annuali ($)
Enzima 1000 37
Supporto - 1040
Reagenti - 1580
Impianto 300 185
Costo prodotto* 1.3 0.28 * cent/libbra
 Sciroppo di glucosio

Saccarosio INVERTASI Glucosio

•Processo sviluppato nei paesi tropicali (estratto di canna da zucchero)

•Processo da barbabietola non competitivo con HFCS
•Invertasi: uno dei primi enzimi ad essere immobilizzati
 Risoluzione ottica di LD aminoacidi

L aminoacido
N-acil LD aminoacido Aminoacido acilasi +
N-acil D aminoacido

ricircolo separazione

Racemizzazione (calore) N-acil D aminoacido

+

Sistemi di immobilizzazione delle aa acilasi: L aminoacido

•Adsorbimento ionico a DEAE-sephdex
•Intrappolamento in fibre di cellulosa triacetato
Gli aminoacidi in forma LD sono quelli prodotti per via chimica (es. LD metionina, LD
alanina e LD treonina)
L’enzima aa acilasi ha bassa specificità di substrato (attiva su vari acil-aa, in genere
acetil-aa)
L’enzima viene estratto da Aspergillus oryzae
 Acido L-aspartico

Fumarato + NH3 ASPARTASI L aspartato

Sistema di immobilizzazione:
•Intrappolamento di cellule intere in poliacrilamide
•Intrappolamento di cellule intere in carragenano+glutaraldeide

Acido malico

Fumarato + H2O FUMARASI Malato

Sistema di immobilizzazione:
•Cellule intere Brevibacterim sp
•Mitocondri immobilizzati
 Idrolisi del lattosio (latte e siero di latte)

Uso del siero idrolizzato:

•Bevande
•Agenti lievitanti
•Mangimi
•Terreno per la produzione di lievito o etanolo
•Prodotti per intolleranti al lattosio

Prima azienda che ha idrolizzato il lattosio:

Centrale del latte di Milano con lattasi da lievito intrappolata in fibre
sintetiche
•Enzima utilizzato:  galattosidasi
•Organismo: Kluyveromyces sp

Problemi di processo: contaminazione batterica

Lattosio  galattosidasi Glucosio + galattosio

 Produzione di acidi 6 amino penicillanico e 7 amino DAO cefalosporanico

Penicillina G, V 6-APA + RCOOH

Penicillina acilasi
Deacetossi cefalosporina 7-ACA + aminoadipato

Più del 50% del 6-APA è prodotto con acilasi immobilizzate

Molti sistemi brevettati: dall’enzima purificato alle cellule intere

Idrolisi di polimeri

Processi:

1. Glucoamilasi: saccarificazione dell’amido

2. Proteasi: idrolisi di proteine (industria alimentare e farmaceutica
3. Rennina (aspartil-proteasi): coartazione della caseina

Processi in fase di studio: il problema principale è l’accessibilità del substrato

all’enzima
 USO DI CELLULE IMMOBILIZZATE NEI PROCESSI FERMENTATIVI

Processi a cellule libere Processi a cellule immobilizzate

•Bassa densità cellulare •Densità cellulare predeterminata

•Limitazioni nutrizionali •Disaccoppiamento crescita-produzione
•Tempi morti (batch) •No washout (continue)

•Costi di immobilizzazione
•Trasferimento di massa
•Applicabilità al processo specifico
Metodi di immobilizzazione: analoghi a quelli per gli enzimi

•Adsorbimento al supporto
•Legame covalente al supporto
•Crosslinking
•Intrappolamento: il più utilizzato (agar, alginato carragenano, cellulose,
collagene, gelatina, poliacrilamide, fotopolimeri etc)

Poliacrilamide: il primo supporto utilizzato

Metodi blandi: molto utilizzati le gelazioni ionotropoche e termiche
Alginato: miglioramento dei processi con la deidratazione parziale, l’indurimento
con glutaraldeide o la ricopertura delle particelle
Produzione di antibiotici

Relazione tra fase di produzione dell’antibiotico (idiofase) e stato delle cellule

immobilizzate

Uso di terreni diluiti e poveri di nutrienti per la crescita

Problema della disponibilità dell’ossigeno nei sistemi immobilizzati per

intrappolamento rispetto all’adsorbimento: co-immobilizzazione di C. acremonium con
l’alga produttrice di ossigeno Chlorella pyrenoidosa

Sistema più studiato: produzione di penicillina G da P. chrysogenum in carragenano

(studi ancora a livello di laboratorio)
Produzione di acido citrico

Problema delle colture batch tradizionali: rifornimento di ossigeno ostacolato dalla

viscosità del terreno quando le biomassa è elevata

Nei sistemi immobilizzati la viscosità è costante e l’aerazione è stabile

Utilizzati sistemi immobilizzati con A. niger e Yarrowia lipolytica

Produzione di acido lattico

Utilizzati diversi batteri lattici intrappolati in alginato

Produzione di acido acetico

Utilizzato Acetobacter sp in fibre cave, ceramica e carragenano

L’ossigeno è il fattore limitante in questi processi
Produzione di enzimi

Utilizzati sistemi immobilizzati per la produzione di enzimi extracellulari:

Produzione in continuo di Amilasi termostabile da Bacillus cereus in alginato in

fermentatore a letto impaccato o letto fluido

Produzione di amilasi termostabile da E. coli ricombinante in carragenano

Produzione di glucoamilasi da Aspergillus sp

Produzione di cellulasi da Tricoderma reesei

Produzione di lignina perossidasi da Phanerochaete chrysosporium

Produzione di penicillin acilasi da E. coli e B. megaterium

Produzione di etanolo

•E’ uno dei sistemi immobilizzati più studiati

•Utilizzati S. cerevisiae e Z. mobilis immobilizzati in fermentazioni continue con risultati
incoraggianti
•Trasferimento su scala industriale in fase di prova: impianti pilota con microrganismi
intrappolati in vari supporti e con prove di produzione per vari tempi e con varie rese
•Uno dei problemi di produzione è lo sviluppo di CO2 in situ
•Studi fisiologici di base sulle cellule immobilizzate
•Co-immobilizzazione di Z. mobilis e A. awamori per la produzione diretta di etanolo da
amido
 Applicazioni industriali:  industria alimentare
 controllo ambientale
 industria farmaceutica (sintesi/trasformazioni)

Applicazioni bioanalitiche e biomediche:

 antigeni e anticorpi per cromatografia di affinità

 ELISA
 recettori e ligandi per per studio di interazioni
 biosensori

 enzimi incapsulati

IDENTIFICAZIONE DI SOSTANZE RIMOZIONE DI METABOLITI E

BIO-ATTIVE NELLA DIAGNOSTICA CORREZIONE DI MALATTIE
DI VARIE MALATTIE METABOLICHE
RILASCIO CONTROLLATO DI
ENZIMI/PROTEINE
 CAMPIONE
lavaggio ELUENTE

ANTICORPO

SUPPORTO

Figura 32.3.1 - Funzionamento della colonna di affinità. L’anticorpo (simboli blu) è immobilizzato al supporto all’interno di
una colonna. Il campione, contenente varie proteine tra cui l’antigene (o la proteina con l’epitopo riconosciuto
specificamente dall’anticorpo), viene fatto fluire attraverso la colonna e sottoposto a lavaggi. Solo le molecole
antigeniche saranno catturate dall’anticorpo (legame di affinità) e trattenute dalla colonna. Potranno essere recuperate
con un opportuno eluente.
ELISA test         Partially purified, inactivated HIV antigens
        pre-coated onto an ELISA plate
 
Patient serum which contains antibodies. If
the patient is HIV+, then this serum will
       
contain antibodies to HIV, and those
       
antibodies will bind to the HIV antigens on the
 
plate.

Anti-human immunoglobulin coupled to an

       
enzyme. This is the second antibody, and it
       
binds to human antibodies.
 

Chromogen or substrate which changes color

positive        
when cleaved by the enzyme attached to the
       
second antibody.
 

negative
 Enzimi immobilizzati nei biosensori

Caratteristiche degli enzimi: • Affidabilità

1. Alta specificità • Sensibilità
2. Alta reattività • Accuratezza

Caratteristiche degli enzimi immobilizzati:

1. Facile manipolabilità
2. Costi contenuti
3. Applicabilità a diagnostica clinica
 Cos’è un biosensore?
Enzima, anticorpo,
Un sensore che incorpora un elemento biologico per acido nucleico,
MONITORARE sistemi viventi o per INCORPORARE microrganismo,
elementi biotici cellula, tessuto
L’elemento biologico è integrato o intimamente
associato con un trasduttore chimico-fisico Ottico,
elettrochimico,
Il biosensore produce segnali (discreti o continui) termometrico,
elettronici digitali proporzionali alla concentrazione piezoelettrico,
dell’ analita magnetico

ANALITA

BIO-
RECETTORE

TRASDUTTORE

segnale
misurabile
Figura 32.3.3 - Schema funzionale del biosensore.
 Membrane
Trasduttore

SEGNALE
ANALITA SEGNALE TRASDOTTO
CHIMICO

Enzimi immobilizzati Supporto

Figura 32.3.4 - Schema funzionale di un biosensore a enzimi immobilizzati.
 METODI DI IMMOBILIZZAZIONE USATI

1. Adsorbimento/legame chimico 1. Carbone

2. Crosslinking su/con 2. Polimeri
3. Intrappolamento 3. Gel
4. Membrane

Supporti più utilizzate:

• materiali inorganici (strutture sol-gel: silice,
silani, allumina etc)
• polivinili e polietileni funzionalizzati
• polietilene perfluorurato (Nafion)
 Nafion (Dupont 1960): membrana ionomerica perfluorosolfonata
Polietilene perfluorinato con non frequenti gruppi acidi solfonici o carbossilici.
• Struttura non esattamente definita
• Resistenza termica e chimica
• Scambio ionico
• Selettività
• Resistenza meccanica
• Insolubilità in acqua

-(CF2CF2)n-(CFCF2)m-

OCF2CF(CF3)-(CF2CF2)-SO3-M+

clusters ionici M+
-
SO3 H2O H O
2
H2O
M +
M+ SO3-
SO3- H2O H O
2
H2O
M+ SO3-
MATRICE IDROFOBICA
(semicristallina)

Figura 32.3.5 - Struttura del NafionR. In alto la formula della molecola polimerica. In basso la struttura della membrana
costituita da celle idrofile (cluster ionici) disperse nella matrice idrofobica (in azzurro).
 Il processo deve essere:

1. Di facile esecuzione
2. Non costoso
3. Massima ritenzione di attività biologica
4. Accessibilità del substrato

Sistema enzimatico più utilizzato:

Bio-recettore: ossidasi che producono H2O2

Analita + O2  prodotto ossidato + H2O2

Trasduttore amperometrico: H2O2  O2 + 2 H+ + 2e-

In questo tipo di biosensori il problema maggiore è dato dalla disponibilità

dell’ossigeno nel bio-recettore
Analiti/enzimi utilizzati in biosensori nelle applicazioni mediche
 glucosio (campione membrana
da misurare)
G G gluconato G Trasduttori alternativi:
Strato di enzimi glucosio + Sensore di pH
O O O
immobilizzati + H 2O 2 + H
+
Sensore di ossigeno
D D D
O2
membrana

Trasduttore + - Corrente (elettrodo

H2O2  O2 + 2H + 2e sensore di perossido)
del segnale
(ossidazione anodica)

Figura 32.3.6 - Struttura del biosensore del glucosio con elettrodo a sensore di perossido (trasduttore elettrico) e con i
trasduttori alternativi del pH e dell’ossigeno.

Quando l’enzima E1 del bio-recettore non produce un segnale chimico

trasducibile (es. acqua ossigenata), può essere necessario accoppiare un
secondo enzima E2:

Analita (E1)  intermedio (E2)  segnale trasducibile (es H+, OH-, O2

etc)

L’ analita può essere l’ inbitore di una attività enzimatica:

In questo caso si otterrà la riduzione di un segnale trasdotto
(elettrico)
 BIOSENSORI OTTICI
(trasduttori fotometrici in alternativa a quelli elettrochimici)

Tecniche di immobilizzazione:
1. Adsorbimento
2. Intrappolamento

Supporti:
3. Silicati trasparenti Variazioni di assorbimento nello
4. Fibre ottiche spettro visibile

Analiti:
5. Glucosio
6. Colesterolo
7. Fosfolipidi
8. Bilirubina

Principio di funzionamento:
Attenuazione della fluorescenza di un colorante sensibile all’ossigeno
consumato dall’enzima del bio-recettore
 Precursore + H2O2 colorante assorbimento

GOD
Glucosio + O2 Acido gluconico + H2O2

h
colorante colorante* colorante (attenuazione)

colorante + fluorescenza no segnale

segnale (cellula fotosensibile)

Figura 32.3.7 - Funzionamento dei biosensori ottici. Al centro la reazione dell’EI, sotto e sopra le reazione alternative di
trasduzione del segnale. Sotto, l’ossigeno reagisce col colorante eccitato dalla luce e ne impedisce l’emissione di
fluorescenza: in presenza dell’analita si consuma l’ossigeno ed il colorante può emettere la fluorescenza,
proporzionalmente alla riduzione dell’ossigeno. Alternativamente, la sintesi del colorante necessita l’acqua ossigenata
prodotta dalla reazione dell’analita (sopra): il concomitante consumo dell’ossigeno permette l’emissione della
fluorescenza.

Problematiche del biosensore ottico: Misura indiretta dell’ analita  tempi di risposta
lunghi

Alternativa: Misura differenziale dell’assorbimento del coenzima della GOD o di altri enzimi

Esempio: Glucosio + GOD(FAD)  acido gluconico + GOD(FADH2)

 BIOSENSORI IMPIANTABILI

Tre tipi di biosensori vengono utilizzati nelle applicazioni cliniche:

1. Biosensori esterni (bed-side units)
2. Biosensori indossabili (monitoraggi a breve termine)
3. Biosensori impiantabili (controllo in continuo ed ‘in vivo’)

Consentono di monitorare in continuo ed in tempo reale:

1. Glucosio nel sangue
2. Dosaggio e somministrazione di farmaci
3. Somministrazione intravenosa di nutrienti

Biosensori impiantabili

Problematiche da affrontare: Necessità di sviluppo:

• biocompatibilità • miniaturizzazione
• risposta immunitaria • integrazione dei componenti
• calibrazione • monitoraggio di più sostanze
• ostruzione
 APPLICAZIONI TERAPEUTICHE DEGLI ENZIMI IMMOBILIZZATI

Usi potenziali:
1. Correzione del metabolismo (lattato ossidasi, fosfolipasi)
2. Trattamenti tumorali (SOD, asparaginasi)
3. Detossificazione sanguigna (eparinasi, fosfolipasi)
4. Rimozione di metaboliti tossici (ureasi, alcol deidrogenasi)

Sistemi utilizzati:
1. Immobilizzazione su supporto solido
2. Incapsulati in matrice (sol-gel)
3. Incapsulati in ‘cellule artificiali’ (liposomi, eritrociti)
4. Uno o più enzimi
 Eritrociti (RBC: Red Blood Cells)

Cratteristiche delle RBC come veicoli di proteine esogene:

1. Risposta immunitaria scarsa o inesistente
2. Facilmente ottenibili (uomo, topo, coniglio)
3. Lunga persistenza nell’ospite
4. Assenza di effetti collaterali tossici

Tecniche di introduzione delle proteine esogene in RBC:

1. Endocitosi
2. Diffusione passiva
3. Elettroporazione (facile)
4. Dialisi ipotonica / resealing isotonico (facile, reversibile e produzione di
cellule stabili in vivo con caratteristiche inalterate rispetto alle cellule di
partenza)
Liposomi

Caratteristiche positive:
•Ridotta tossicità
•Enzimi incapsulati con conservata attività

Caratteristiche negative:
•Rapido smaltimento dei liposomi iniettati (macrofagi)

Miglioramenti del sistema:

Rivestimento con PEG (liposomi stabilizzati)

•Aumento emivita
•Diversa farmaco-cinetica
•Diversa biodistribuzione
•Possibilità di ligandi esterni per bersagli
cellulari specifici
 Incapsulazione in sol-gel

Meccanismo di formazione di sol-gel a partire da alcossidi MOR

(M=metallo Si, Al, Ti, Zr etc; R=radicale alchilico):
1. Idrolisi: MOR  MOH + ROH
2. Condensazione: MOH + MOH  MOM + H2O
3. Condensazione: MOR + MOH  MOM + ROH
4. Polimerizzazione: ----MOMOMOM---- (reticolo tridimensionale
omogeneo dell’ossido
5. Formazione di particelle sospese in fase liquida (diametro circa
100nm)  sol
6. Aggregazione delle particelle  formazione del gel

Caratteristiche del sistema di immobilizzazione sol-gel:

•Formazione del supporto con caratteristiche costanti e riproducibili
•Stabilità termica
•Enzimi attivi, stabili e non soggetti a leakage