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BIOTECNOLOGIE e BIOLOGIA MOLECOLARE

INTRODUZIONE
BIOLOGIA MOLECOLARE (Warren Weaver,
1938): è una branca della biologia che studia i
meccanismi molecolari che stanno alla base della
fisiologia degli esseri viventi, concentrandosi soprattutto
sulle interazioni esistenti tra le macromolecole, ovvero
proteine e acidi nucleici (DNA e RNA).
Spesso si intende anche una serie di tecniche che
consentono la rilevazione, l'analisi, la manipolazione,
l'amplificazione (PCR) e la copia (clonaggio) degli acidi
nucleici.

La BIOTECNOLOGIA è l'applicazione tecnologica che


si serve dei sistemi biologici, degli organismi viventi o di
derivati di questi per produrre o modificare prodotti o
processi per un fine specifico.

La nascita della biologia molecolare si può però far risalire alla


scoperta della struttura del DNA
IL DNA

Johan Friedrich Miescher (1844-1895): presenza di vari composti


chimici ricchi in fosfato all'interno dei nuclei dei leucociti → nucleina.
► Identificazione del DNA come molecola responsabile della
conservazione e della trasmissione dei caratteri ereditari.

Rosalind Franklin e Maurice Wilkins: studio del DNA mediante l’analisi ai raggi X.

James Watson & Francis Crick: 1953 → costituiscono il


modello definitivo della molecola di DNA

Nature 171, 737 - 738 (25 April 1953); doi:10.1038/171737a0


Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for
Deoxyribose Nucleic Acid
J. D. WATSON & F. H. C. CRICK
CARATTERISTICHE DEL DNA

• Contiene le istruzioni che dirigono:


1) la divisione cellulare ESPRESSIONE GENICA
(trascrizione del RNA, sintesi
2) la crescita delle cellule
delle PROTEINE)
3) il differenziamento dei tipi cellulari

• E’ in grado di duplicarsi
REPLICAZIONE del
accuratamente e fedelmente
DNA

• Costituisce la base per i processi MUTAZIONE e


evolutivi
SELEZIONE NATURALE
STRUTTURA DEL DNA

GRUPPO FOSFATO

1) Il DNA è un acido nucleico ed è costituito BASE


da NUCLEOTIDI. AZOTATA

ZUCCHERO

PURINE PIRIMIDINE

adenina e guanina timina e citosina


Estremità 5’
2) I nucleotidi si legano con legami covalenti a costituire un
FILAMENTO di DNA.

3) Due filamenti complementari di DNA si appaiano


tramite ponti a idrogeno per formare una MOLECOLA di
DNA.

Estremità 3’

La complementarietà delle basi azotate


IL GENOMA
► Le molecole di DNA stanno all’interno delle cellule degli organismi viventi e nel loro insieme
costituiscono il GENOMA di questi organismi.

GENOMA dei PROCARIOTI GENOMA degli EUCARIOTI

E’ formato da una unica molecola E’ formato da numerose molecole lineari


circolare ed è localizzato nel fortemente compattate ed è localizzato
CITOPLASMA delle cellule all’interno del NUCLEO delle cellule
GENOMA UMANO

DNA nucleare DNA mitocondriale

► DNA MITOCONDRIALE

I mitocondri sono organuli


MEMBRANA INTERNA cellulari localizzati nel
citoplasma e deputati a
MEMBRANA ESTERNA
svolgere il processo di
RESPIRAZIONE CELLULARE,
e per questo motivo sono
anche detti ‘CENTRALE
ENERGETICA’ della cellula.
CRESTA MITOCONDRIALE
MATRICE MITOCONDRIALE
► E’ costituito da una MOLECOLA di DNA CIRCOLARE lunga 16569 bp (TEORIA
SIMBIONTICA)

→ 37 geni:

→ REGIONE NON CODIFICANTE


D-loop

• lunga circa 1200 bp


• le mutazioni si accumulano per effetto del caso
• contiene 3 regioni ipervariabili: HVR-I, HVR-II
e HVR-III → rivelano circa il 3% della variabilità
tra individui.
► E’ il tipo di DNA più utilizzato negli studi popolazionistici e nelle ricostruzioni filogenetiche
perché presenta alcune caratteristiche peculiari:

a) esiste in un elevato numero di copie per cellula

b) si eredita per sola via materna  non ricombina

c) ha un elevato tasso di mutazione


COME SI CONDUCE UNO STUDIO SUL
DNA

1) Estrazione del DNA: tutti i passaggi di questa fase hanno lo scopo di liberare il
DNA dalle cellule per metterlo in soluzione.

2) PCR (Polymerase chain reaction): tecnica di amplificazione del DNA “in vitro”.
Consente di isolare il solo frammento di interesse e
di ottenerne un elevato numero di copie fedeli.

3) Elettroforesi: consente di visualizzare il DNA amplificato e di separare i filamenti di DNA


in base alla loro lunghezza.

4) Reazione di sequenza: si tratta di una PCR “modificata”!! Il risultato finale è la


visualizzazione sul pc della sequenza nucleotidica del frammento
d’interesse.

5) Analisi delle sequenze e costruzione di alberi filogenetici


ESTRAZIONE DEL DNA

SCOPO: liberare il DNA dalle cellule per metterlo in soluzione.

Procedura generica per DNA da tessuto


vivente:

a) Soluzioni saline: rompere le membrane cellulari

b) Tensioattivi: solubilizzare i lipidi

c) Proteinasi K:
K digerire le proteine
AMPLIFICAZIONE DEL DNA: PCR

SCOPO: isolare il frammento di DNA d’interesse dal restante DNA genomico


ed ottenerne milioni di copie

VANTAGGI: ♦ Non è necessario isolare il frammento di DNA d’interesse dal


restante DNA genomico
♦ In poche ore si ottengono milioni e miliardi di copie del frammento
d’interesse
♦ Si impiega un numero limitato di reagenti
♦ L’allestimento della reazione è semplice
♦ E’ una tecnica molto sensibile → bastano poche molecole di DNA
di partenza

♦ Perché un ciclo di reazione si compia, devono verificarsi numerose


MA… interazioni tra le molecole presenti in provetta
♦ Possono avvenire degli errori nel corso della replicazione in vitro →
copie non fedeli all’originale
…INGREDIENTI
1) DNA – bastano anche pochissime molecole di partenza

2) Due oligonucleotidi d’innesco: PRIMERS

3) Basi azotate: deossinucleotidi trifosfati

4) DNA polimerasi: Taq-polimerasi

5) Tamponi salini: buffer e MgCl2


UN CICLO DI PCR…

1) Fase di denaturazione → 94°C

2) Fase di annealing → 50-60°C

3) Fase di estensione → 72°C

Thermalcycler
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ELETTROFORESI

SCOPO: visualizzare il DNA amplificato e separare


i filamenti di DNA in base alla loro
lunghezza.

Viene utilizzato un GEL DI AGAROSIO

Solieria robusta
PREPARAZIONE DI UN GEL D’AGAROSIO

1) Tampone salino (TEA 1X)

2) Agarosio

3) Bromuro di Etidio

• In soluzione acquosa, i filamenti di agarosio si dispongono a formare una rete


tridimensionale, le cui maglie sono più o meno larghe a seconda della concentrazione.

• La concentrazione di un gel si esprime in termini di percentuale. La quantità di agarosio


necessaria per preparare un gel ad una certa percentuale, dipende:
→ volume finale del gel
→ dimensioni della vaschetta elettroforetica
PRINCIPIO DELL’ELETTROFORESI

Le molecole di DNA sono dei POLIANIONI


(presentano gruppi carichi negativamente)

♦ Sottoponendo il gel di agarosio ad un campo elettrico, le molecole di DNA


migreranno, attraverso le maglie della rete di agarosio, dal polo negativo al polo
positivo

♦ La velocità di migrazione delle molecole di DNA dipende dalla loro dimensione

♦ In uno stesso intervallo di tempo piccoli frammenti di DNA compiranno nel


gel uno spostamento maggiore rispetto a frammenti di dimensioni maggiori
RISULTATO FINALE…
1) Il gel viene posto su un transilluminatore a luce ultravioletta

2) La posizione dei frammenti di DNA è rivelata sotto forma di bande fluorescenti di colore viola

•••
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REAZIONE DI SEQUENZA CON TERMINATORI
‘BigDye’
Metodo di Sanger
► E’ una reazione di PCR modificata in cui viene inserito un reagente in più

miscela di 4 TERMINATORI MARCATI A FLUORESCENZA:

♦ Un terminatore è un DI-DEOSSI-NUCLEOTIDE (ddNTP), cioè un nucleotide del DNA che in posizione 3’


reca un atomo di ossigeno in meno se durante la sintesi di un filamento di DNA viene inserito un ddNTP LA
SINTESI SI BLOCCA.

A G

♦ I quattro ddNTP terminatori sono coniugati


(“marcati”) a quattro diversi FLOUROCROMI
molecole che, se colpite da un raggio di luce laser,
T C EMETTONO FLUORESCENZA.
dNTP

ddNTPs
… ALL’INTERNO DEL SEQUENZIATORE:


i frammenti della miscela vengono separati e
ordinati secondo la loro lunghezza →
ELETTROFORESI CAPILLARE


i frammenti vengono colpiti da un raggio di luce
laser che eccita i fluorocromi coniugati ai
terminatori

• viene rilevata un’emissione di fluorescenza di


colore diverso per ognuno dei quattro
terminatori → l’emissione viene trasformata in
picchi di colore diverso, con
aree proporzionali all’intensità di emissione.


un software ricostruisce la sequenza del
frammento iniziale di DNA abbinando a ciascuna
emissione luminosa il corrispondente ddNTP