Universidade Federal de Pernambuco

Departamento de Química Fundamental

Química Analítica

Técnicas de Separação

Eletroforese
 Eletroforese
A eletroforese é definida como o transporte de compostos
carregados eletricamente em solução eletrolítica (soluções-tampão)
sob a influência de um campo elétrico, no qual a separação
entre dois solutos ocorre de acordo com
as diferenças entre suas mobilidades

 Início (1937-Arne Tiselius)

Eletroforese livre (sem suporte) : Soro sanguíneo em cinco

frações protéicas principais

Prêmio Nobel: 1948

 Atualmente é utilizada em vários setores: químicos, bioquímicos,

indústrias farmacêuticas, ciência forense, etc....
Ex.: Separação de frações de proteínas, enzimas, DNA e RNA
 Fundamentos da Eletroforese

Direção do movimento
Força de atrito Força elétrica é
retardadora é dada pela equação
dada pela
Lei de Stokes Força de atrito Força fe = ze
fv = 6rv retardadora elétrica

ze
6πηrν  ze ν 
6πηr
ν  μ e e

Onde,  = velocidade do íon;  = campo elétrico; ze = carga do elétron;

 = viscosidade; r = raio da partícula;e = mobilidade eletroforética;
Comportamento de Aminoácidos

 Em meio neutro (pH=7)

H H Glicina

O O
+
H2 N C C H3N C C
- Estado de equilíbrio
OH O formando íon dipolar
H H

 Em meio alcalino (pH>7), comporta-se com um ácido

H H
O O
H2N C C + - Fica negativamente
OH H2N C C
OH - carregado
O
H H

 Em meio ácido (pH<7), comporta-se como uma base

H H
O O
H2N C C + + + Fica positivamente
H H3N C C
OH carregado
OH
H H
 Separação de espécies anfóteras, como proteínas e
polipeptídios

Propriedades de Compostos Anfipróticos*

 Ex.: Glicina dissolvida em água

NH3+CH2COO- + H2O NH2CH2COO- + H3O+ Ka=2x10-10

NH3+CH2COO- + H2O NH3+CH2COOH + OH- Kb=2x10-12

NH2CH2COOH NH3+CH2COO- ** Tipo interno de

reação ácido/base

Zwitterion

(*) tem a capacidade de doar e receber prótons

(**) Aminoácido suportando uma carga positiva ou negativa
 Propriedades de Compostos Anfipróticos


 
[H 3O ] [ NH 2CH 2 COO ] [OH  ][ NH 3 CH 2 COOH ]
Ka  Kb  

[NH 3 CH 3COO  ] [NH 3 CH 3COO  ]


[NH 2 CH 2 COO  ]  [ NH 3 CH 2 COOH]

K a [H 3O  ] [ NH 2 CH 2 COO  ] [H 3O  ] K w [H 3O  ]  OH 
 
K b [OH ][ NH 3 CH 2 COOH ] [OH  ]
 

 Ka Kw
[H 3O ] 
Kb
 Ponto Isoelétrico (pI) da Glicina

 É o pH no qual a molécula apresenta carga líquida igual a zero,

isto é, cargas positivas e negativas são iguais.

 O movimento sob a ação do campo elétrico é nulo.

Ka Kw Ka=2x10-10
[H 3O  ] 
Kb Kb=2x10-12
Kw=1x10-14
2  10 -10
 1  10 -14
[H 3O  ]   1  10 6

2  10-12

pI   log(110 6 )  6

O zwitterion da glicina é mais forte como ácido do que como base

 Movimento das espécies na eletroforese

 Soluções-tampão

As espécies são transportadas por uma solução tampão que

se desloca sob ação de um campo elétrico.

O pH das soluções-tampão dita qual vai ser o sentido do

deslocamento.

Soluções-tampão com baixa força iônica permitem migrações

mais rápidas oferecendo menor resistência.
 Exemplo de eletroforese de proteínas séricas
Em pH>pI a albumina e a -globulina estão negativamente
carregadas

+
H3N – …… – COO- + OH-  H2N – …... – COO-
Glicina

Proteína neutra tampão Proteína carregada negativamente

A albumina (pI=4,7) tem uma densidade de cargas positivas maior

que a -globulina (pI=7,2).

[carga +]albumina > [carga +]-globulina

Em pH=8,6 a albumina perde mais H+ que a -globulina e fica com

uma densidade de carga negativa maior.

[carga -]albumina > [carga -]-globulina

Exemplo de eletroforese de proteínas séricas
[carga -]albumina > [carga -]-globulina

Eletroferograma de proteínas séricas

A albumina terá uma maior

velocidade, migrando muito mais
rápido para o polo positivo (anodo)
do que a -globulina

globulinas
(

Tempo (min)
 Suportes usados em Eletroforese

 Acetato de celulose
 Gel de Agarose
 Gel de Amido
 Gel de Poliacrilamida

Solução Eletrolítica (tampão)

 Tampão Tris-Tricina para proteínas, pH 8,7

 Tampão Tris-Glicina para hemoglobina, pH 9,5
 Tampão Tris-Glicina - Glicinato de Sódio para lipoproteínas,
pH 9,2
 Tampão Fosfato para hemoglobina ácida, pH 6,2
 Tampão para hemoglobina glicosilada, pH 6,4
 Tampão para proteínas de alta resolução, urina e líquor,
pH 8,8
 Tipos de Eletroforese

 Eletroforese em Placa (Clássica)

 Eletroforese Capilar (Versão instrumental)

 Eletroforese em Placa (Clássica)
 Eletroforese em Placa
Separação realizada em fina camada plana ou placa de gel poroso
semi-sólido que contém uma solução-tampão aquosa em seus poros

E = 125 V
 Eletroforese em Placa

Eletroferograma
Eletroferograma

Pico M

placa

placa

O mieloma múltiplo é um câncer que

afeta a medula óssea
Eletroforese Capilar
Aparelhagem
 Eletroforese Capilar
Aparelhagem
Capilar Detector

Fonte de alta tensão

Reservatórios de
solvente
 Eletroforese Capilar (1980)

Velocidade de Migração

A velocidade de migração () de um íon depende da intensidade

do campo elétrico,  (determinado pela magnitude do potencial
aplicado (E) e do comprimento (L) sobre o qual ele é aplicado).

E
ν  μ e ν  μe
L

Potenciais altos devem ser aplicados para se obter migração

iônica e separação rápidas
 Eficiência da Separação Eletroforética
Separações rápidas são necessárias mas, ainda mais importante,
é a obtenção de uma boa resolução
A eficiência aumenta à medida que o número de pratos (N) torna-
se maior e a altura do prato (H) diminui.

Equação de Van Deemter

H  A  B u  Cu

Caminhos Coeficiente de transferência

múltiplos de massa
Difusão
longitudinal

Como uma única fase está envolvida na eletroforese, somente

a difusão longitudinal precisa ser considerada.
 Eficiência da Separação Eletroforética

μeE
N
2D

D = coeficiente de difusão

Como a resolução aumenta com o número de pratos (N), é

desejável aplicar um potencial alto para obter separações
com uma boa resolução

Na eletroforese, o número de pratos não aumenta com o

aumento do comprimento da coluna
 Fluxo Eletroosmótico
Quando se aplica um potencial através de um tubo capilar contendo
uma solução-tampão, usualmente ocorre um fluxo eletroosmótico

Grupos
silanóis
Flu
xo elet ionizados
capilar roo
s mó
tico

Dupla camada
na interface
sílica/solução

Com um potencial aplicado de 25 kV, um tampão de 50 mM e pH = 8,0 flui através

de um capilar de 50 cm de comprimento em direção ao catodo a aproximadamente
5 cm/min
 Fluxo Eletroosmótico

Eletroforese Cromatografia líquida

(Potencial aplicado) (Eluente e eluato bombeados)

Pressão eletroosmótica Pressão hidrodinâmica

O fluxo eletroosmótico tem perfil plano* porque os cátions ou

ânions estão solvatados e carregam consigo também as
moléculas de água não contribuindo significativamente com o
alargamento da banda

(*) Na cromatografia é parabólico devido a pressão da coluna

 Velocidade do Fluxo Eletroforético

A velocidade do fluxo eletroosmótico (eo ) é maior que a

velocidade de migração do fluxo eletroforético (e )

A velocidade do fluxo eletroosmótico

νe  μ e E é a bomba de fase móvel na
eletroforese capilar

Suficiente para varrer todas as espécies

νeo  μ eo E positivas, neutras e negativas para a
mesma extremidade do capilar de modo
a serem detectadas quando passam por
um ponto comum (detector)
 Eletroferograma

É o registro gráfico da eletroforese. Tem o formato de um

cromatograma.

νe1  μ e1 E
νe 2  μ e 2 E

νe 3  μ e3 E
νe 4  μ e 4 E
νe 5  μ e 5 E
νe1  νe 2  νe 3  νe 4  νe 4
 Velocidade do Fluxo Eletroforético

Na presença de eletroosmose, a velocidade de um íon

é a soma de sua velocidade de migração (e) com a
velocidadede fluxo eletroosmótico (eo )

ν  νe  νeo

νe  μ e E νeo  μ eo E

ν   μ e  μ eo  E
 Velocidade do Fluxo Eletroforético
A mobilidade eletroforética (e) do ânion tem sinal negativo

Ordem de Eluição

_ 1. Cátion mais rápido(++)

+ 2. Cátion mais lento(+)
3. Todos os neutros em
uma única zona
4. Ânions mais lentos (-)
5. Ânions mais rápidos (- -)

Pode se inverter a direção do fluxo eletroosmótico com a adição

de um surfactante catiônico ao tampão  adsorve na parede do
capilar deixando-o positivamente carregado
 Instrumentação para Eletroforese Capilar

Pode se inverter a
polaridade da alta
tensão para separar
ânions

Introdução da Detecção da
amostra em uma amostra na outra
extremidade do tubo extremidade do tubo

 Capilar de sílica fundida preenchido com solução-tampão

SiOH
interno = 10 a 100 m
Comprimento = 40 a 100 cm sílica SiOH
Volume interno do capilar = 4 a 5 L
SiOH
Volume de injeção da amostra = da ordem de nanolitros

 Dois reservatórios com solução-tampão com dois eletrodos de platina

 Introdução da Amostra

 Injeção Eletrocinética (5 a 50 nL)

A extremidade do capilar é imerso em um recipiente que contém
a amostra e um potencial é aplicado por um tempo determinado
fazendo com que a amostra entre no capilar por: migração iônica,
e fluxo eletroosmótico.
Ela discrimina a injeção de quantidades maiores de íons com maior
mobilidade em relação a íons mais lentos

 Injeção sob Pressão

A extremidade do capilar é imerso em um recipiente que contém
a amostra e uma diferença de pressão* é então usada para dirigir
a amostra para o capilar
(*) - Vácuo na extremidade do detector
- Pressurização da amostra
- Elevação da extremidade do capilar
 Detectores
Como os analitos passam pelo ponto de detecção (detector)
com velocidades diferentes, os picos apresentam áreas que
dependem dos tempos de retenção.
Aplicações da Eletroforese Capilar

Modos de separação

1. Eletroforese Capilar por Zona (CZE)

2. Eletroforese Capilar em Gel (CGE)

3. Isotacoforese Capilar (CITP)

4. Focalização Isoelétrica Capilar (CIEF)

 1. Eletroforese Capilar por Zona (CZE)

A composição do tampão é constante na região de separação

O potencial aplicado faz com que os diferentes componentes

iônicos da mistura migrem de acordo com a sua própria
mobilidade e se separem em zonas que podem ser bem
resolvidas ou apresentarem superposições parciais
 1. Eletroforese Capilar por Zona (CZE)
 Separação de íons pequenos
Os íons do analito são deslocados na mesma direção
do fluxo eletroosmótico

Separação de Cátions: As paredes do capilar não são tratadas e o

fluxo eletroosmótico e o movimento dos cátions vão em direção ao catodo

capilar
- - - - - - - - - - - - -
+ + + + + + + + + + + + +
+ - - +
+ +
+ -
- - + + -
Grupos + + + + + + + + + + + + +
silanóis - - - - - - - - - - - - -
ionizados

Fluxo eletroosmótico

1 – rubidio,2 – potássio,3 -cálcio,4 – sódio,5 – magnésio,6 – lítio,7 – lantânio,8 – cério),9 – praseodimio,10 – neônio
11 – samário,12 – európio,13 – gadolínio,14 –terbio,15 –disprosio,16 –olmio,17 – erbio,18 – túlio ,19 - Iterbio
 1. Eletroforese Capilar por Zona (CZE)
 Separação de íons pequenos
Os íons do analito são deslocados na mesma direção do fluxo eletroosmótico

Separação de Ânions: O fluxo eletroosmótico é invertido tratando as paredes

do capilar com sal de alquilamônio (cetil-trimetilamônio)

capilar
- - - - - - - - - - - - -
+ + + + + + + + + + + + +
- - - - - - - - - - - - -

+ - - +
+ +
+ -
- - + + -
- - - - - - - - - - - - - Íons
Grupos + + + + + + + + + + + + + alquilamônio
silanóis - - - - - - - - - - - - -
ionizados

Fluxo eletroosmótico

1, tiossulfato; 2, brometo; 3, cloreto; 4, sulfato; 5, nitrito. 6, nitrato; 7, molibdato; 8, azida; 9, tugstato; 10, monofluorofosfato;
11, clorato; 12, citrato; 13, fluoreto; 14, formiato; 15, fosfato; 16, fosfito; 17, clorito; 18, galactarato; 19, carbonato; 20, acetato;
21, etanossulfonato; 22, propionato; 23, propanossulfonato; 24, butirato; 25, butanossulfonato; 26, valerato; 27, benzoato;
28, l-glutamato; 29, pentanossulfonato; 30, d-gluconato
 1. Eletroforese Capilar por Zona (CZE)
 Separação de espécies moleculares
Herbicidas, pesticidas e fármacos sintéticos pequenos que são
Iônicos ou cujos derivados podem ser iônicos

Anti-inflamatórios

1, naproxeno;
2, ibuprofeno;
3, tolmetina
 1. Eletroforese Capilar por Zona (CZE)
 Separação de espécies moleculares
Proteínas, aminoácidos e carboidratos*

Mistura de proteínas modelo

Pico
1
2
3
4
5

(*)Carboidratos neutros: As separações

são precedidas pela formação de complexos
de borato carregados negativamente
 2. Eletroforese Capilar em Gel (CGE)
Separação é feita em uma matriz polimérica porosa de gel, cujos poros
contêm uma mistura tamponada na qual a separação é feita
Esse meio gera uma ação de peneira molecular que retarda a migração das
espécies em diferentes graus, dependendo dos tamanhos dos poros do polímero e do
analito

Gel: polímero de poliacrilamida (mais comum)

agarose
metilcelulosa
polietileno glicol Aplicação
Separação de Macromoléculas

Proteínas, fragmentos de DNA

e oligonucleotídeos que têm
substancialmente a mesma
carga mas tamanhos diferentes.

1, -lactalbumina; 2, inibidor de tripsina de soja; 3, anidrase carbônica; 4, ovalbumina; 5, soroalbumina bovina; 6, fosforilase B
 3. Isotacoforese Capilar (CITP)
(Iso = igual ;Taco = velocidade)

(Quando todas as bandas do analito migram na mesma velocidade)

Utilizam-se as diferenças nas mobilidades eletroforéticas de cátions

e ânions, em relação aos íons dos eletrólitos líder e terminal

1) c/ íons de maior mobilidade

Separação do que os íons do analito (eletrólito líder)
2) c/ íons de mobilidade mais
(Duas soluções tampão) baixa os íons da amostra (eletrólito terminal)
 Exemplo: Separação de uma amostra de cátions
Eletrólito líder : deve possuir cátions cuja mobilidade seja maior que a dos
íons a serem separados
Eletrólito terminal : deve possuir cátions com mobilidades inferiores aos
cátions da amostra.

Separação das zonas de amostras

Estado inicial

Estado intermediário

Estado em equilíbrio (cada zona contém um único tipo de íon)

“Todas as zonas migram, na mesma velocidade do íon do eletrólito líder, em direção

ao eletrodo correspondente”
 4. Focalização Isoelétrica Capilar (CIEF)
(separação de espécies anfóteras, como proteínas e polipeptídios)

Os analitos são separados de acordo com seus pontos isoelétricos (pI) isto é, o valor
do pH no qual o anfólito tem carga residual nula.

No pI não ocorre migração sob a ação de um campo elétrico.

A amostra é misturada com uma série de reagentes, denominados anfólitos

carreadores, que possuem boa capacidade tamponante em seus valores individuais
de pI.

Um gradiente de pH é obtido quando se aplica o campo elétrico, fazendo com que
ocorra uma movimentação do soluto, de acordo com o valor do pH.

Em valores de pH mais baixos que o pI dos analitos, estes migram para
o catodo, pois estão positivamente carregados.

Em pH mais alto, eles migram para o anodo, pois estão carregados negativamente.
 No pI não ocorre migração sob a ação de um campo elétrico.
 A amostra é misturada com uma série de reagentes, denominados anfólitos
carreadores, que possuem boa capacidade tamponante em seus valores
individuais de pI.
geração do gradiente de pH

introdução da amostra

estado estacionário.
 4. Focalização Isoelétrica Capilar (CIEF)

As bandas que primeiro

chegam ao detector
correspondem as proteínas
com o pI mais alcalino