Comienzos

Desarrollada por Mikhail

Tswett, en 1906 con el
fin de separar los
colorantes que componen
a las plantas.
Comienzos

Consistía en una columna de vidrio rellena de CaCO3 a la cuál

se le colocaba la muestra en la parte superior y se le
circulaba éter de etilo, logrando que las sustancias más
afines al solvente salieran de la columna más rápidamente
que las menos afines.
Definición
• La cromatografía es una técnica que permite separar los diferentes
componentes de una mezcla compleja.

• La separación se logra por diferencias en la movilidad relativa de los

solutos, lo cual se logra por las distintas interacciones físicas y químicas
entre los componentes de la cromatografía.
Componentes básicos de una
cromatografía

– Fase estacionaria
– Fase móvil
– Soluto o muestra
Clasificación
Se aplican varios criterios

• De acuerdo al soporte

• Al tipo de equilibrio que se establece en la

separación

• Al estado de agregación de la fase móvil

Según el soporte
Cromatografías Planas
Ventajas

• Sencillas

• Rápidas

• Bajo costo
 Cromatografías Planas

Desventajas

• Solo con fines analíticos

• Poca eficiencia en la separación

• No se adapta a sistemas automatizados

Según el soporte
Cromatografías en columna
Ventajas
• Mas versátiles
• Se adaptan a sistemas automatizados
• Mayor resolución
• Mayor capacidad de carga
• Posibilidad de escalado a nivel productivo
 Cromatografías en columna
Desventajas

– Necesidad de equipamiento

– Alto costo inicial

– Requiere personal capacitado

Según el tipo de equilibrio

Método especifico Fase estacionaria Tipo de equilibrio

Líquido – líquido Líquido adsorbido Distribución entre
sobre un sólido líquidos inmiscibles

Líquido - sólido Sólido Adsorción

Resinas de Intercambio iónico

Intercambio iónico

Gel Exclusión

Sólidos/gel Afinidad
Clasificación según equilibrio

• Cromatografía de reparto: El soluto está en

equilibrio entre el líquido de la fase móvil y
el de la fase estacionaria por diferencias de
solubilidades.
• Cromatografía de adsorción: Fenómeno
superficial en el cual las partículas del
soluto son adsorbidas por la fase
estacionaria.
Clasificación según equilibrio

• Cromatografía de intercambio iónico: Los iones

del soluto son retenidos por los grupos funcionales
que se encuentran en la fase estacionaria.
• Cromatografía de exclusión molecular: No hay
equilibrio de separación . Se separan por el
tamaño partículas.
• Cromatografía de afinidad: reacción inmunológica
donde el soluto es el antígeno y los anticuerpos se
encuentran adsorbidos en la fase estacionaria.
 PARAMETROS A
CONSIDERAR EN
CROMATOGRAFIA
Algunos conceptos previos
CROMATOGRAMA

Tiempo de retención= tiempo que transcurre desde la

inyección de la muestra hasta que el soluto alcanza el
detector( a veces esta magnitud se mide en volumen de
elución)

Tiempo muerto= es el tiempo Ancho del pico en la base= es el

necesario para que una especie que no tiempo transcurrido desde que
se retiene en la fase estacionaria el soluto alcanza el detector
alcance el detector hasta que lo abandona
Algunos conceptos previos
Factor de retraso (Rf)= factor que se obtiene
experimentalmente y me permite establecer la
distancia recorrida por un soluto en relación a
la fase móvil. Aplica en las cromatografías
PLANAS

Rf= Distancia recorrida por la muestra

Distancia recorrida por el solvente
Ejemplo 1
Se realizo un cromatografía en capa delgada para determinar la presencia
de rojo cobalto en una muestra de pigmentos textiles. Para tal caso se
corrió junto con las muestras un patrón de colorantes que contenía la
muestra problema . Una vez terminada la cromatografía se midió la
distancia recorrida por el solvente arrojando un valor de 8,6 cm; la
muestra presento una distancia recorrida de 5,6cm y 7,4cm mientras
que el patrón presento medidas de 2.9 cm, 5,7cm y 6,8cm.¿cual es el
valor de Rf de las muestras y el patrón de colorantes? ¿se encuentra el
colorante en cuestión en la muestra?
Patrones Rf= d muestra/d solvente 2.9/8.6=0.33
5.7/8.6=0.66
6.8/8.6=0.79

5,6/8,6=0.65
Muestras Rf= d muestra/d solvente
7,4/8,6=0.86
Constante de distribución(Kc)= Valor teórico
que relaciona la concentración de un soluto
entre la fase móvil y la fase estacionaria.

Concentración molar del

Kc=Cs analito en la fase
Cm estacionaria

Concentración
molar del analito
en la fase móvil
Factor de retención (k) = factor que se puede determinar
experimentalmente y permite comparar la velocidad de
migración de los diferentes solutos.

k= Tr – Tm
Tm

IMPORTANTE: k <<<<< a 1 soluto muy poco retenido

k entre 1 y 5 valor ideal
k 20 o mayor cromatografías muy largas
Factor de selectividad (α)= relaciona los
tiempos de retención de dos solutos y por lo
tanto me permite saber la eficacia de la
columna para separarlos.

α = (Trb) –Tm = Valor siempre > 1

(Tra)-Tm

IMPORTANTE= ESTE FACTOR NO

TOMA EN CUENTA EL ANCHO DE
PICO
Poder de separación de las columnas

Concepto de Plato Teórico (N)

Altura de la
Altura del plato (HEPT) H= L fase
estacionaria
N
Ejemplo 2

Cual será el número de platos teóricos y la altura

equivalente de un plato para una columna de 30cm
si el cromatograma para la determinación de
dichos parámetros mostró los siguientes
resultados: Tr=22,3 N=16(Tr/W)2
W=1.12 N=16 x(22.3/1.12)2=6342

HEPT=L/N=30/6342
H=0.004 cm
ASIMETRIA =As

As=b/a
Ideal=1
Aceptable=0.8 a 1.3
RESOLUCION = R
RESOLUCION (R)
Ejemplo 3

Determinar la resolución de una columna que

presenta los siguientes valores de corrida:
TrA=16.40 WA=1.11
Tr B= 17.63 WB= 1.21

Rs= 2 x 17,63-16.40
1.11 + 1.21
Rs=1.10
Índice de polaridad

Magnitud que permite cuantificar la polaridad

relativa de una mezcla de solventes que
componen la fase móvil

IPAB =(vol. relativo de A x IP de A) + (vol. relativo de B x IP de B)

Índice de polaridad

• El valor de IP de cada solvente lo obtengo

de tabla.
• Es conveniente trabajar, como mínimo, con
dos solventes de polaridad diferente.
• Es un parámetro a considerar cuando
necesito aumentar la resolución, por
ejemplo, en una cromatografía de adsorción.
Elución por gradiente
Índice de polaridad
Factores que afectan la eficiencia
de la cromatografía
 Difusión
longitudinal

Efecto de
trayectorias
múltiples
Difusión

• Tamaño de partícula de la fase estacionaria

• Sobrecarga del sistema

• Uniformidad del sistema

Algunas técnicas de optimización

• REDUCIR LA ALTURA DE PLATO

• MODIFICAR LA FASE MOVIL
• AUMENTAR LA VELOCIDAD DE
FLUJO
• AUMENTAR EL DIAMETRO DE LA
COLUMNA
HPLC

El HPLC (High Performance Liquid

Chromatography) o CLAR (Cromatografía
Líquida de Alta Resolución) es el método
más moderno para realización de
cromatografías.
Aplicaciones del HPLC

• Para pesos moleculares mayores a 10000 se utilizan

cromatografías de permeación por geles y cromatografía
de fase reversa.
• Para pesos moleculares menores a 10000 y especies
iónicas se utiliza Cromatografía por Intercambio Iónico.
• Para especies no iónicas, polares y pequeñas se utiliza la
cromatografía por partición o reparto.
• Para especies no polares e isómeros estructurales,
hidrocarburos alifáticos y alcoholes alifáticos se utiliza la
cromatografía por adsorción o líquido sólido.
Por qué utilizar HPLC

• El HPLC es un método caro para el análisis

de muestras, pero por otra parte es
sumamente efectivo.
• Optimiza cientos de veces la velocidad de la
cromatografía en columna.
• Es altamente reproducible (siempre que
utilicen las mismos condiciones de corrida
se obtendrán los mismos resultados).
Por qué utilizar HPLC

• Tiene una alta sensibilidad: en la

cromatografía en columna de vidrio se
utilizaban grandes cantidades de solvente,
lo que diluía la muestra, disminuyendo la
sensibilidad del método.
• Excelente para la cuantificación debido a
los detectores on-line que utiliza.
Fase móvil

El tipo y la composición de la fase móvil

(eluyente) son variables que influyen en la
separación.
Las propiedades comunes a los diversos
disolventes que se emplean son:
Fase móvil

• Alta pureza (del orden de 99,999%).

• Compatibilidad con el detector.
• Solubilidad de la muestra.
• Baja viscosidad.
• Inercia química.
• Precio razonable
Instrumentación
Instrumentación
• Son 8 componentes básicos:
• Reservorios de la fase móvil.
• Sistema de suministro de solvente.
• Elemento para introducir la muestra.
• Columna.
• Detector.
• Reservorio de residuos.
• Tuberías de conexión.
• Integrador o computadora.
Reservorios de fase móvil

• Recipientes de materiales inertes (vidrio o acero

inoxidable) de entre 200ml y 1000ml.
• Equipados generalmente con un degasificador
para que no ingresen burbujas al sistema.
• También cuentan por lo general con un filtro en
la salida para el equipo.
Fase móvil
En la cromatografía se pueden usar eluciones con un
solo solvente (elución ISOCRATICA) o con
diferentes solventes que varían sus
concentraciones con el tiempo (elución en
GRADIENTE).
Esta segunda forma de suministrar solvente suele
generar mejores separaciones.
Para poder realizar una elución en gradiente es
necesario contar con una computadora para
programar la variación de solventes en función
del tiempo de corrida.
Fase móvil

Las propiedades de los eluyentes que se

pueden variar para producir elución en
gradiente son:
• Fuerza iónica.
• pH.
• Constante dieléctrica.
Bombas

• Sistema de suministro de disolvente.

• Debe asegurar un suministro de caudal libre de
pulsos, constante, reproducible y preciso.
• Si se provocan pulsos en los flujos, estos son
indeseables pues:
• Causan problemas a la hora de la detección.
• Impiden un buen análisis cuantitativo.
• Conducen a una temprana falla de la columna.
Bombas

Existen actualmente 3 tipos de bombas para

los equipos de HPLC:
• Reciprocantes o a pistón.

• Tipo jeringa o de desplazamiento.

• Neumática o de presión constante.

Bomba de pistón
• Se usan en el 90 % de los equipos y
consisten generalmente en una cámara
pequeña (35 μL a 400 μL), en la que el
disolvente se bombea hacia delante y hacia
atrás mediante un pistón movido por un
motor.
• Dos válvulas que se abren y cierran
alternadamente, controlan el flujo del
disolvente hacia adentro y fuera de un
cilindro.
Bombas de pistón
En el movimiento hacia atrás, el pistón aspira el
eluyente desde el reservorio y debido a las
válvulas de chequeo se cierra la salida a la cámara
de separación.
Durante el avance, el eluyente es empujado dentro de
la columna y la entrada del reservorio se cierra.
El movimiento de bombeo del pistón produce un
flujo de pulsos que requiere atenuación.
Estas bombas generan una alta presión de salida con
caudales constantes y la posibilidad de usar la
elución por gradiente.
Bomba de pistón
Muestras

Antes de inyectar la muestra en el equipo, hay que

tenerla en estado líquido o en solución, y tener en
claro que sea compatible tanto con la fase móvil
como con la fase estacionaria.
Se pueden inyectar cantidades que varían entre 1 μl
a 100 μl; generalmente se inyectan entre 5 μl y
10 μl.
Las cantidades inyectadas varían dependiendo de la
sensibilidad y el rango dinámico del detector.
Muestras

El tiempo de análisis puede variar entre 5 min

y 2 hs dependiendo del tiempo de
preparación de la muestra, entre otras cosas.
La preparación de cada muestra es totalmente
diferente, y puede consistir en una
hiperfiltración, dilución, preconcentración,
extracción, etc.
Precolumnas

Se colocan antes de la columna analítica para

incrementar su vida, eliminando el material
particulado y los contaminantes del
solvente.
Además, sirven para saturar la fase móvil con
la fase estacionaria de manera de minimizar
las pérdidas del solvente de la columna
analítica.
Precolumnas

La composición del relleno de la columna

de guardia debe ser similar a la de la
columna analítica, pero el tamaño de
partículas es generalmente más grande
Cuando se contamina, se rellena
nuevamente o se descarta y reemplaza
por una nueva delmismo tipo.
Columnas

Se construyen de acero inoxidable, plástico,

aunque a veces hay de vidrio.
En el caso de ser de vidrio (menos común), la
presión máxima de trabajo es 600 psi.
Los precios de la columnas rellenas varían de
200 a 500 dólares.
Columnas analíticas
La mayoría de la columnas tiene entre 10 cm
y 30 cm.
Normalmente son rectas y pueden tener largos
adicionales como acoples de una o más
columnas.
El diámetro interior está comprendido entre 4
mm y 10 mm.
Los tamaños de partícula del relleno más
comunes son 3 μm, 5 μm ó 10 μm.
Columnas analíticas
Las columnas más comunes miden 25 cm de
largo, 4,6 mm de diámetro interior y con
relleno de partículas de 5 μm, tienen entre
40 000 platos/m y 60 000 platos/m.
Se han producido columnas aún más
pequeñas, con largos de 3 cm a 7,5 cm.
Pueden tener hasta 100 000 platos/m, con
mucha velocidad y consumo mínimo de
solvente.
Rellenos de columnas

Existen dos tipos de relleno en las columnas

de cromatografía:

• Pelicular.
• Partícula porosa.
Relleno pelicular

Consiste de bolillas esféricas, no porosas, de

vidrio o polímero, con diámetros típicos de
30 a 40 μm.
Se deposita una delgada capa porosa de sílice,
alúmina, una resina sintética de poliestireno
– divinil benceno o una resina de
intercambio iónico, sobre la superficie de
estas bolillas.
Relleno pelicular

Para algunas aplicaciones, se aplica un

recubrimiento adicional, que consiste de
una fase estacionaria líquida que se
mantiene adsorbida.
Pueden también ser tratadas químicamente
para dar una capa de superficie orgánica.
Se emplean más para las precolumnas y no
tanto para las columnas analíticas.
Relleno poroso

Consiste de micropartículas porosas que tienen

diámetros entre 3 μm a 10 μm.
Las partículas son comunmente de sílice, pero
también pueden ser de alúmina, una resina
sintética de poliestiereno – divinil benceno o
una resina de intercambio iónico.
Relleno poroso
Se preparan las partículas de sílice
aglomerando sub-micropartículas de sílice
bajo condiciones que conducen a partículas
más grandes que tiene diámetros muy
uniformes.
Las partículas resultantes se recubren a
menudo con películas orgánicas delgadas,
que son unidas química o físicamente a la
superficie.
Detectores

El rol más importante del detector de HPLC

es monitorear los solutos a medida
que eluyen.
Genera una señal eléctrica, proporcional al
nivel de alguna propiedad de la fase móvil o
de solutos.
Detectores
Las características necesarias de un buen
detector de HPLC son:
• Sensibilidad.
• Linealidad.
• Confiabilidad.
• Fácil de usar.
• Bajo volumen muerto.
Detectores
Existen dos grandes grupos de detectores:
• De propiedades masivas, moduladas por la
presencia de solutos, como por ejemplo, el
índice de refracción o la densidad de la fase
móvil.
• De propiedades del soluto, como por ejemplo
absorbancia de radiación UV, fluorescencia o
corriente de difusión. Estos son más sensibles
que los primeros en el orden de 1000 veces o
más.
Detector de absorbancia al UV

• Es utilizado en más del 70 % de los equipos

HPLC.
• La señal es proporcional a la concentración
del soluto.
• Se detectan alquenos, compuestos
aromáticos y aquéllos que tienen uniones
múltiples de C, O, N, y S.
• La fase móvil no debe interferir en la
detección.
Detector de absorbancia al UV
Se mide la absorbancia de los eluyentes de
una columna y para minimizar el
ensanchamiento de banda, se mantiene el
volumen lo más pequeño posible, entre 1μl
y 10μl y largos de celda entre 2 mm y 10
mm.
Están restringidos a presiones debajo de 600
psi, por lo que se requiere un reductor de
presión.
Solventes en el UV
Otros detectores

• De conductividad: es un detector universal

de iones, pero no sirve para elución en
gradiente.
• Electroquímicos: miden la corriente
electrica asociada a la oxidación o
reducción de los solutos a la salida de la
columna, y son especialmente sensibles,
pero no sirven para elución en gradiente.
Columnas mas utilizadas en HPLC
Cromatografía de reparto
• Es la más utilizada, y se la puede subdividir
en líquido - líquido y de fase unida según
como se une la fase estacionaria a las
partículas de relleno.
• En la líquido – líquido, la fase estacionaria
es mantenida sobre la superficie de las
partículas del relleno por adsorción física.
• En la fase unida, se une químicamente a las
partículas del soporte.
Cromatografía de reparto

• La más antigua es la de equilibrio líquido –

líquido pero actualmente es mas utilizada la
de fase enlazada .
• La desventaja más importante de la líquido
– líquido es la pérdida de fase estacionaria
por disolución en la fase móvil, lo que
requiere recubrimientos periódicos del
soporte
Fase normal y reversa

Dentro de este equilibrio se trabaja con dos tipos

de fases estacionarias:
Fase Normal: el componente principal de la fase
estacionaria es muy polar(ej. silice) y la fase
móvil es poco o medianamente polar.
• Bajo estas condiciones los compuestos
poco polares eluyen primero, no bstante
pueden cambiarse las condiciones variando el
IP del solvente
Fase normal y reversa

• Actualmente en desuso ya que ciertos

solventes modifican de a poco la fase
estacionaria, perdiendo reprudicibilidad
Fase normal y reversa
• Fase Reversa: La fase estacionaria es poco
polar, normalmente silica tratada (siloxano)
con R de C8H17 (C-8 o n-octil) a C18H37
carbonos (C-18 o n-octildecil)
Fase normal y reversa

• La fase móvil es polar

• En estas condiciones los compuestos menos
polares son mas retenidos eluyendo primero
los mas polares junto con la fase móvil
• Son actualmente las mas utilizadas y su vida
media es mayor a las de fase normal.