REACCIONES

ANTIGENO-ANTICUERPO: TÉCNICAS
 REACCIONES INTERACCION PRIMARIAS

Las interacciones primarias entre un antígeno y un

anticuerpo no son visibles a simple vista por lo que necesitan
de un marcaje (Fluorescencia, Radiomarcaje, enzimatico,
etc)

REACCIONES DE INTERACCION SECUNDARIA

Visibilizan las reacciones antígeno anticuerpo a través de

reacciones de aglutinación o precipitación
REACCIONES DE PRECIPITACIÓN
INMUNODIFUSION DOBLE (PRECIPIATCION)
AGLUTINACION EN LATEX (FACTOR REUMATOIDEO)
PRUEBAS HEMAGLUTINACION
 REACCIONES INTERACCION PRIMARIAS

APLICACIONES
MARCACION METODO DETECCION VENTAJAS DESVENTAJAS
RECOMENDADAS

contador gama, peliculas de Fácil de cuantificar, facil de marcar vida media corta, Potencialmente Inmunoensayos cuantitativos y
Yodo
rayos X directamente, alta sensibilidad peligrosos para la salud cualitativos, inmunoblots

Multiples pasos, algunos sustratos son IHC, inmunoensayos

Sustratos cromogénicos Vida media larga, alta sensibilidad,
Enzima peligrosos, enzimas endogenas, pobre cuantitativosy cualitativos,
detectados por OD visualización posible directa,
resolución en IHC inmunoblots
Larga vida media, alta sensibilidad, IHC, inmunoensayos
avidina /estreptavidina Multiples pasos, algunos sustratos son
Biotina detección universal, escogencia de cuantitativosy cualitativos,
acoplada a varias marcaciones peligrosos, biotina endogenas
metodos de detección inmunoblots
UV exitación y espectro
Larga vida media, buena resolución
visible, detectado por Autofluorescencia, "quenching",
Fluorocormos en inmunohistoquimica, analisis IHC, FACS, cell sorting
microscopio, fluorometro, Multiples pasos, baja sensibilidad
sobre celulas vivas
citometro
 ESQUEMA GENERAL REACCIONES ANTIGENO-
ANTICUERPO
Visualizacion revelado

Conjugado

Ac primario
(Especifico)

BLOQUEO/
FIJACION

ANTIGENO
 ELISAs

“Enzime-linked immunosorbent assay” es una

técnica altamente versatil, sensible, y cuantitativa.
ABSORBANCIA Y LEY DE BEER-LAMBERT
 PASOS GENERALES ELISA

1. Unión de anticuerpo o antígeno a la fase sólida (coating):

2. Se forman una o más capas de complejos sobre la fase sólida:

2. Reacción colorimetrida entre el enzima fijado y el sustrato cromogénico:
 ELISAs
Directa: aplicación en detección de Ags solubles
en diferentes muestras

Indirecta: aplicación en detección de anticuerpos

específicos contra antígeno presentes en plasma u
otros fluídos corporales

“Sandwich”. Aplicación en detección de antígenos

solubles

Competitiva: se compite contra un Ag o Ac de

concentración conocida y marcado
 ELISA directa ELISA indirecta

4. Adicionar sustrato

3. Adicionar sustrato
3. Adicionar anti-Igs E
conjugada a Enzima
2. Acs específico
conjugado a E 2. Adicionar suero
enzima

1. Adicionar 1. Adicionar Ag
mezcla Ag puro (coating)
SOLIDA
(coating) SOLIDA
 ELISA Sandwich directa ELISA Sandwich indirecta

5. Adicionar sustrato
4. Adicionar sustrato
4. Adicionar anti-Igs E
conjugada a Enzima
3. Adicionar Acs
reconocimiento 3. Adicionar Acs
conjugado a enzima reconocimiento

2. Adicionar 2. Adicionar
mezcla Ag mezcla Ag

1. Adicionar Acs 1. Adicionar Acs

Captura (coating) Captura (coating)
SOLIDA
SOLIDA
SUTRATOS PARA ELISA
PUNTO DE CORTE ELISA
- Densidad Óptica que permite discriminar entre un valor
positiva o negativo en una prueba de ELISA.
- Se define de acuerdo a los controles negativos de la prueba.

Ejemplos de Cutoff:

Media + 1DS
Media + 2DS
Media + 3DS

Región de Incertidumbre

Controles Controles
Positivos Negativos
- Sensibilidad de la prueba se define a través de los controles
positivos de la prueba.
 COMO CALCULAR EL PUNTO DE
CORTE ELISA USANDO CURVAS ROC
 Sensibilidad = (Verdaderos Positivos/ total positivos)x 100

Sensibilidad = (a / a + b) x 100

Especificidad = (Verdaderos Negativos/ total negativos)x 100

Especificidad = (d / c + d) x 100
 CURVAS ROC

cutoff % Sensibilidad % Especificidad 100- % Especi

0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
“CRISS-CROSS SERIAL DILUTION ANALYSIS” PARA DETERMINAR
CONCENTRACIONES OPTIMAS DE REACTIVOS

REACTANTE SECUNDARIO

ANTIGENO HOMOLOGO ANTIGENO HETEROLOGO

200 50 12,5 3,12 0,78 0 200 50 12,5 3,12 0,78 0
Reactante Terciario

500 Sobre Sobre Sobre 3200 1000 0 500 120 40 20 10 0

250 Sobre Sobre Sobre 2060 560 0 300 80 20 0 0 0
125 Sobre Sobre 3650 1370 360 0 195 40 10 10 0 0
62,5 3600 4000 2270 790 240 0 120 30 10 10 10 0
31,25 2700 2100 1200 410 120 0 60 10 10 10 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
EJERCICIO 1
EJERCICIO 1
PRECISION VS EXCATITUD