Biosintesis de Farmacos

Doctorado en Ciencias en Química Aplicada
Asignatura: Biosíntesis de Fármacos
Profesor: Dr. en C. Miguel A. Vilchis-Reyes
Estudiante: M. en C. Eduardo De la Cruz-Cano
Cunduacán, Tabasco. Agosto, 2019

Unidad 1.- Microbiología y Cultivo
Celular Industrial
Tema 1.1.- Aislamiento, selección, conservación
y mejoramiento de cepas para uso industrial.
• Introducción a la microbiología industrial
2) Empezó con:
1) Utiliza los procesos de fermentación
microorganismos para alcohólica.
obtener productos con valor Procesos microbianos para la
comercial. síntesis de productos
farmacéuticos.
3) En la biotecnología los
métodos de manipulación
génica han dado lugar a
nuevos productos
microbianos
• Okafor, N. (2016). Modern industrial microbiology and biotechnology. CRC Press.

• Collins, C. H., & Beale, A. J. (Eds.). (2015). Safety in industrial microbiology and biotechnology. Elsevier.
• Aislamiento de cepas
Para este proceso se debe considerar:
Las características del producto • Indicará dónde tomar las

y del proceso. muestras
• Indicara cómo diseñar los

Las características ecológicas
medios de aislamiento para
de la muestra.
los microorganismos.

• Selección de cepas
Debido a que el éxito o fracaso de un proceso fermentativo comienza con la cepa utilizada, en la selección de esta se deberían tener en cuenta ciertos
criterios generales que se indican a continuación:
Genéticamente estable.
Velocidad de crecimiento alta.
Libre de contaminantes.
Sus requerimientos nutricionales deberían ser satisfechos a partir de medios de cultivo de costo reducido
De fácil conservación por largos períodos de tiempo.
Deberá llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo corto
De fácil extracción del medio de cultivo.

• Conservación de cepas
Los objetivos de la conservación de las cepas se podrían resumir en los siguientes aspectos:
Preservar la pureza genética del cultivo sin pérdida de ninguna de

sus propiedades bioquímicas
Preservar los niveles de su productividad inicial
Lograr que el cultivo pueda ser transportado (fácil manejo).

• Métodos de conservación de cepas
Subcultivos
Mantenimiento
bajo capa de Congelación
aceite
Cultivos en
Preservación
tierra
en celulosa
Liofilización

Método de Subcultivos
Consiste en resembrar la cepa cada cierto tiempo en un medio de cultivo nutritivo fresco
Ventajas Desventajas

Mantenimiento bajo capa de aceite
Consiste en cubrir completamente el cultivo después de su desarrrollo en medio sólido, con una capa de aceite
mineral o vaselina estéril.
Ventajas Desventajas

Congelación
Es una técnica de elección para cortos o largos períodos de tiempo
Involucra el crecimiento del cultivo hasta la fase estacionaria (en esta etapa las
células son más resistentes a los daños por congelación y descongelación).
Las células a congelar pueden ser resuspendidas directamente en un agente

crioprotector o se puede agregar el mismo como aditivo al medio de cultivo (p
ejemplo el glicerol al 10%).

Cultivos en tierra.
1. La tierra estéril se inocula con un cultivo y se incuba varios días para

inducir esporulación de bacilos aerobios y anaerobios
2. Posteriormente, la tierra es secada (desecador) y el cultivo mantenido

de esta forma en una atmósfera seca o en refrigerador.
3. Utilizado ampliamente en hongos y actinomycetes.

Liofilización
Involucra el congelamiento de un cultivo seguido por un secado al vacío, lo

cual resulta en la sublimación de agua de la suspensión celular.
Apropiada para la conservación de bacterias Gram-positivas, esporas,

actinomycetes y muchos hongos incluidas levaduras.
No es adecuada para células animales y hongos en fase de micelio.

• Mejoramiento de cepas para uso industrial
La productividad potencial de un mcroorganismo es controlada por su genoma, pudiendo el mismo ser modificado para
incrementar los rendimientos. Por lo tanto, la obtención de cepas modificadas genéticamente se puede realizar por:
Selección natural de
variantes
Mutación inducida Recombinación genética

Selección natural de variantes
Consiste en la observación de las características morfológicas de las colonias, el cual permite

seleccionar y estudiar los clones aislados
Involucra la etapa de crecimiento seguida por ensayos de evaluación.
Los resultados de los ensayos en tubos o pequeños frascos son menos confiables en
comparación con experiencias en matraces de erlen-meyers de hasta 500 ml

Mutación inducida
Implica: Agentes mutágenos Físicos Agentes mutágenos Químicos
• El tratamiento de la población con • Luz ultravioleta. La longitud de • Acido nitroso. Induce transiciones
un mutágeno. onda puede variar de 200 a 300 nm A-T --- G-C y/o deleciones.
y el tiempo de exposición entre 0.5 • N-metil-N'-nitro-N-
• El aislamiento de los mutantes para y 20 minutos, dependiendo de la nitrosoguanidina (NTG). Es uno
su posterior ensayo. sensibilidad del organismo. de los mutágenos más potentes,
produciendo una alta tasa de
• Rayos X. Son actualmente poco mutación con bajo porcentaje de
• Los mutantes pueden ser: mortandad.
utilizados.
 con niveles mejorados de • Análogos de base.
metabolitos primarios
• Mutágenos estructurales.
 Productores de enzimas de
interés industrial.

Recombinación genética
Consiste en seleccionar la mejor combinación de genes responsables de codificar la producción de determinado
metabolito.
Virus. Se emplean para
iintercambio de material
genético entre cepas
heterogénicas
Entre especies. El intercambio Bacterias. Se emplean para el

de material genético se da por intercambio de material
Fusión celular. genético a través del pilis,

Tema 1.2.- Obtención de cepas mediante
ingeniería genética.
• Introducción
Ingeniería
Técnicas bioquímicas Técnicas genéticas para genética.
para manipular el ADN in transferir
(procedimiento
vitro el ADN de una célula a otra. de clonado de
ADN)

• Importancia de la ingeniería genética
Los genes de
cualquier tipo pueden
ser alterados y
reinsertados en el
mismo tipo de
microorganismo o en
otro diferente.
A través del
procedimiento de
clonado de ADN

• Desarrollo de la ingeniería genética
fue posible gracias al descubrimiento de:
Enzimas de restricción. Reconocen y cortan el ADN en sitios bien

definidos, generando fragmentos de distintos tamaños. Reconocen
secuencias de 4 o 6 bases.
Plásmidos. son moléculas de ADN circulares, originalmente aisladas de

bacterias y que pueden extraerse de las mismas e incorporarse a otras. Son
empleados como “vectores”.

• Vectores (aspectos conceptuales)
Vector. se define como una molécula de ADN de doble cadena (DNAds), con capacidad de
albergar un fragmento de ADN exógeno (de otro origen).
Vectores de clonación. Son aquellos cuyo objetivo es el almacenamiento y obtención de grandes

cantidades de ADN insertado de la molécula recombinante.
Vectores de expresión. son aquellos cuyo objetivo es producir un transcrito (ARN) o la proteína.
Los vectores de expresión pueden ser plásmidos o fagos.

• Características de un vector ideal para uso industrial
Deberá ser pequeño
De fácil preparación y replicación en la célula huésped
No generar productos tóxicos para la misma
Contener al menos un sitio donde se pueda integrar el ADN exógeno sin destruir
una función esencial (replicación)

Tema 1.3.- Medios de Fermentación y cultivo.
Requerimientos nutricionales. Formulación
• Introducción
La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa

fundamental para asegurar la productividad de los mismos.
Los componentes de los medios deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de
formación de productos y además suministrar energía para la síntesis de metabolitos y para el
mantenimiento celular.

• Categorías de componentes nutricionales de los microorganismos
• Macronutrientes. Representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg

a)
• Micronutrientes. Representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co.
b)
• Factores de crecimiento. Constituidos por componentes orgánicos que no son sintetizados por
las células (como vitaminas, algunos aminoácidos, ácidos grasos no saturados, etc.).
c)

• Clasificación de los medios con base en su naturaleza química
1) 2)
Medios sintéticos. Medios Medios complejos. Intervienen

químicamente definidos. sustancias de origen animal o vegetal
como peptonas, extracto de levadura,
macerado de maíz, harina de soja, etc.

En el estudio de los medios de cultivo hay que considerar:
Diseño
Optimización
de los
Formulación
medios de
cultivo

Requerimientos Disponibilidad de
Diseño
nutricionales los componentes
Deben estar disponible para ser

Tiene como finalidad la elección de usados por la célula.
Están determinados por el tipo de
los componentes necesarios para Con el objeto de prevenir la
metabolismo celular del
lograr el crecimiento y la formación precipitación de iones metálicos, es
microorganismo.
de productos. necesario usar algún agente
quelante, como el EDTA

• Materias primas fundamentales
Fuentes de carbono Fuentes de Nitrógeno
1. De naturaleza inorgánica:
Amoníaco
1. Hidratos de carbono Sales de amonio
2. Alcoholes como el glicerol 2. De naturaleza orgánicas:
3. Hidrocarburos Peptonas (obtenidas por
hidrólisis enzimática de distintas fuentes
proteicas)

• Componentes empleados en la industria de la fermentación
Extracto de
Extracto de carne levadura Extracto de malta
Disponible en forma de
pasta o polvo, y puede
Se obtiene por extracción Extracto soluble en H2O de
ser obtenida mediante
acuosa la malta de la cebada.
autólisis o plasmólisis de
la levadura

• Formulación
Implica los aspectos cuantitativos de los
medios, es decir se debe establecer las
concentraciones de cada componente a ser
utilizadas.
Depende de la composición de biomasa del

microorganismo a ser empleado

Tema 1.4.- Biorreactores. Cultivo continuo, por
lote, sumergido, inmovilizado.
• Biorreactor o fermentador (aspecto conceptual)
Mezclado
control del Termostatiza

pH -ción
Equipo donde se
realiza el proceso
fermentativo
Entradas
para adición Suministro
de de oxígeno
nutrientes

http://biofermt.blogspot.com/2013/11/un-biorreactor-es-un-recipiente-o.html
• Funciones que realiza el biorreactor
Mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen de cultivo.
Mantener constante la temperatura.
Minimizar los gradientes de concentración de nutrientes.
Suministrar oxígeno que satisfaga el consumo
mantener el cultivo puro.

modo de
sistemas de operar el
Cultivo (métodos de cultivo) biorreactor
*Cultivo continuo
*Cultivo discontinuo, por lotes o batch
*Semicontinuo.

• Cultivo continuo
El caudal de entrada de medio fresco es igual al de salida de medio utilizado.
*mayores posibilidades de control.

*Grandes inconvenientes con
Ventajas
*Utilizados en cultivos donde la respecto al mantenimiento.

velocidad de crecimiento celular es
constante. *Tendencia a formar agregados
de las células vegetales en
*Opera bajo condiciones de estado cultivo.
de equilibrio.
*Lento crecimiento celular.
*Es posible estudiar el efecto de
variables como pH, temperatura,
Desventajas
concentración de nutrientes, etc

• Cultivo discontinuo o por lote (batch culture)
El microorganismo crece a partir de una limitada cantidad de medio hasta que se agota un
nutriente esencial y se acumulan productos tóxicos hasta niveles que inhiben el crecimiento.

Inicial: Tiene lugar mientras los organismos se acostumbran al nuevo entorno.
Exponencial : fase de crecimiento a la máxima velocidad específica.
Lineal (ralentización) : tiene lugar cuando aparece un nutriente que llega a ser limitante.
Estacionaria : las condiciones se vuelven limitantes
Declive : comienza a haber muerte celular a un ritmo significativo.

• Cultivo sumergido
Los nutrientes se encuentran forma líquida
Los microorganismos se desarrollan formando agregados más o

menos esféricos (pellets).

• Cultivo inmovilizado
Permite alcanzar altas

Proporciona estabilidad a las
concentraciones celulares en
funciones celulares.
volúmenes reducidos
Estudios han demostrado que el metabolismo de

células inmovilizadas es mucho mayor en
comparación al presentado por células libres

PRINCIPAL RESULTADO:
Los hongos filamentosos puede usarse como fabricas
metabólicas, ya que pueden procesar y secretar proteínas
recombinantes.
• Rosales-Cueto, L. L., Martínez-Campos, R., Regalado, C., & Romero-Gómez, S.

PRODUCCIÓN DE LISOZIMA POR Aspergillus niger B1 EN CULTIVO
INMOVILIZADO USANDO UN MEDIO DE CULTIVO OPTIMIZADO PARA
FERMENTACIÓN SUMERGIDA.
Tema 1.5.- Inoculación. Crecimiento
microbiano y celular.
• Introducción
En microbiología, la palabra “crecimiento” se define como un incremento
en el número de células o de masa celular por unidad de tiempo de una
población microbiana.
Si un microorganismo es cenocítico, es decir, multinucleado, en el que las

divisiones nucleares no se acompañan de divisiones celulares, el
crecimiento produce un incremento de tamaño pero no del número de
células.
El crecimiento ocasiona un aumento del número de células cuando los

microorganismos se multiplican por procesos como gemación o fisión
binaria.

Cuando se siembran microorganismos en
un medio de cultivo apropiado
los mismos comienzan a dividirse

activamente empleando los nutrientes que
le aporta el medio de cultivo para
"fabricar" nuevos microorganismos
Este proceso continúa hasta que algún

nutriente del medio de cultivo se agota
(sustrato limitante) y el crecimiento se
detiene.
También puede detenerse el crecimiento

por acumulación de alguna substancia
inhibidora formada por los mismos
microorganismos

• Aspectos que influyen en el crecimiento microbiano
Estequiométrico Cinético
La concentración final de
microorganismos obtenidos
El que dirá con qué velocidad
dependerá de la concentración
se lleva a cabo el proceso
y composición del medio de
cultivo.

• Estequiometria del crecimiento microbiano
Estudia las relaciones aritméticas entre las masas o volúmenes de los reactantes y los
productos en una reacción química llevada a cabo por los microorganismos.
Los cálculos estequiométricos permiten determinar las relaciones másicas y molares
entre los reactantes y los productos finales en los procesos fermentativos.
¿Cual es la concentración final de microorganismos o productos obtenidos

respecto de la concentración de los componentes (sustratos) del medio de
cultivo ? Esta información se deduce de las ecuaciones de reacción escrita y
balanceadas correctamente y de los pesos atómicos pertinentes.

• Estequiometria del crecimiento microbiano
El proceso de crecimiento microbiano implica que se lleven a cabo reacciones de generación de energía y
de biosíntesis.
La siguiente estequiometría describe un sistema de crecimiento microbiano a base de glucosa como
sustrato:
La estequiometría global (Ec. 1) es el resultado de la suma de la reacción de aporte energético (Ec. 1a)
y de síntesis (Ec. 1b).
La de aporte energético determina la cantidad de trabajo útil que puede ser efectuado por la célula.
La reacción de síntesis consumirá parte de la energía producida.
La reacción se completa cuando toda la glucosa ha sido convertida a productos de oxidación

(respiración) o de síntesis.
Los rendimientos alcanzados en biomasa y productos son de
relevancia significativa debido a que el valor de los sustitutos
empleados en la formulación de medios de cultivo tiene una
importancia sustancial en el costo de operación de las plantas
industriales. .
El grado en que un microorganismo puede transformar los

componentes del medio de cultivo en nueva biomasa y productos
juega un papel fundamental, a punto tal que puede llegar a ser
factor determinante de la viabilidad de un proceso en gran escala.
Desde este punto de vista, resulta de sumo interés poder llegar a
determinar, estimar o predecir rendimientos que den cuenta de
las transformaciones que se están llevando a cabo en un
biorreactor.

• Cinética del crecimiento microbiano
Se refiere a la velocidad, con que transcurre el

proceso. Por lo tanto, la velocidad a la que
ocurre una reacción biológica puede ser
modelada asumiendo diferentes hipótesis.

Representación matemática de cinéticas biológicas

Los modelos segregados. Reconocen como diferentes a las "células más viejas" de
las "células más jóvenes”.
Los modelos no segregados. Consideran que una "célula promedio" puede

representar toda la población.
Los modelos estructurados. Modelan a la célula (a la biomasa) como un sistema de

componentes múltiples (ribosomas, enzimas, membranas,etc).
Los modelos no estructurados.Todos los componentes celulares se representan por

una única concentración, la de la biomasa (X).
Una reacción biológica real debería ser representada por un
modelo segregado estructurado. Sin embargo, los modelos no
segregados no estructurados son usados por su simplicidad
matemática y por su capacidad de representar adecuadamente un
vasto conjunto de reacciones biológicas de interés. Los modelos no
segregados no estructurados suelen llamarse del tipo "Caja Negra".

•Velocidad de reacción enzimática
importancia • Las reacciones enzimáticas no

• Reacción tienen por que estar asociadas al
enzimática. Cualquier crecimiento de bacterias en
reacción química que • Las enzimas permiten la forma simultánea, de hecho no
sea catalizada por una producción de químicos es necesario la existencia de
enzima (que es una con una especificidad bacterias en un medio para que
proteína). muy elevada a ciertos se dé una reacción enzimática.
isómeros.
Aspecto
conceptual Consideraciones

•Velocidad de reacción biológica (reacción única) -Modelo de Monod (1942)
En una reacción biológica son varios los sustratos que

participan en ella, las bacterias crecen y utilizan
muchísimas enzimas para llevar a cabo la reacción
biológica deseada.
Monod en 1942 desarrolló una ecuación muy simple

para representar los procesos biológicos, en la que
asumió que si bien pueden existir muchos sustratos,
uno de ellos será el limitante.

En este modelo se asume que la producción de biomasa
depende exclusivamente de la concentración de este
sustrato limitante. Para una reacción biológica la velocidad
de crecimiento de biomasa puede representarse como
sigue:

• Factores que influyen sobre el crecimiento microbiano
Numerosos factores afectan el crecimiento de los

microorganismos en los procesos industriales, y, a
menudo, sus interacciones tienen un efecto significativo
sinérgico o antagónico sobre el crecimiento. Estos
efectos interactivos pueden ser muy importantes en los
sistemas alimentarios, en los cuales el crecimiento
bacteriano puede verse favorecido o inhibido por los
múltiples condiciones o constituyentes alimentarios.

Temperatura
En condiciones de baja temperatura, un aumento eleva la

velocidad de crecimiento, porque la velocidad de una
reacción catalizada por enzimas, como de cualquier
reacción química, casi se duplicará por cada incremento
de 10 ºC. Como la velocidad de cada reacción aumenta, el
metabolismo en general es más activo a temperaturas
altas, y el microorganismo crece más rápidamente.

pH
Variaciones intensas en el pH pueden dañar a los

microorganismos alterando la membrana plasmática o
inhibiendo la actividad de las enzimas y proteínas
transportadoras. Los cambios en el pH externo pueden
modificar también la ionización de las moléculas de
nutrientes, disminuyendo, por ello, su disponibilidad
para el organismo

Luz ambiental
La mayoría de los microorganismos crecen mucho

mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar.
Hay excepciones evidentes como sería el caso de los
microorganismos fotosintéticos.

Condiciones adecuadas de humedad
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como

en la atmósfera, es imprescindible para un buen
desarrollo de las células vegetativas microbianas en los
cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas
condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37
ºC cuando sea necesario que mantenga la humedad
necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así
que se deseque el medio.

Tema 1.6.- Métodos de monitoreo del producto.
El Monitoreo y Control de productos se refiere
al conjunto de actividades que permiten verificar si
el proceso biotecnológico (incluyendo el control de
calidad) va marchando según lo planificado.

Importancia
• El monitoreo es una
forma de evaluación
aunque a diferencia de la • El monitoreo permite
evaluación de resultado, establecer a los procesos
tiene lugar poco después biotecnológicos qué está
que comenzó una funcionando y qué no, así
intervencion y durante el hacer ajustes a lo largo
proceso biotecnológico. de dicho proceso.
Aspecto
conceptual

• El monitoreo de productos permite:
Implementar medidas correctivas para poner al proceso

biotecnológico nuevamente en curso y que los resultados
(producto) que se esperan sea el que se logre.
Recolectar información que puede usarse en el proceso de

evaluación.
Cuando las actividades de monitoreo no las llevan a cabo

directamente los tomadores de decisiones, es crucial que los
hallazgos de las actividades monitoreadas se coordinen y se
los retroalimente
• El monitoreo como parte del proceso biotecnológico implica:
Almacenamiento
Monitoreo
Validación de
fecha de Documentación
vencimiento

Almacenamiento
Debe realizarse siguiendo las indicaciones del fabricante. Por ejemplo, algunos se
almacenan a temperatura ambiente, otros refrigerados (principalmente aquellos que
contienen sangre, yema de huevo, telurito, etc.), o al abrigo de la luz, o en ambiente con
humedad controlada, etc.
Que el lugar de almacenamiento se encuentre dentro del rango de temperatura

establecido
Si el fabricante no establece el período de vigencia, éste debe ser establecido en el

laboratorio

Documentación
Es crucial la trazabilidad en la preparación de los medios a nivel industrial, por lo tanto se debe registrar toda la
información posible:
Fecha de preparación
Responsable de preparación
Lote y vencimiento del medio de cultivo deshidratado
Batch del lote preparado
Peso teórico
Balanza utilizada.

Validación de la fecha de vencimiento
El laboratorio debe crear un protocolo que incluya los siguientes test: pH,
apariencia, esterilidad y test de de crecimiento a ser llevados a cabo al
menos en tres lotes de cada medio de cultivo al cabo de la fecha de
vencimiento establecida.
Efectuar el control de calidad del medio de cultivo nuevo recientemente

elaborado, en paralelo con el anterior que está en uso.

Tema 1.7.- Purificación del producto. Criterios
de pureza, actividad biológica.
Introducción
La pureza microbiológica se determina mediante la demostración de

la presencia de contaminantes bacterianos y fúngicos, mientras que
la estabilidad genética se comprueba comúnmente por verificación
de mutaciones listadas en los fenotipos.
La pureza del producto es un valor relativo a la sensibilidad de los

métodos que se utilizan por lo que es importante descartar
contaminantes de especies relacionadas que pueden encontrarse en
una baja concentración.
Pérez-Reytor, D. C., Domínguez-Vázquez, I., Olano-Ruiz, E., & Sosa-Espinosa, A. E. (2010). Estrategia de verificación de calidad de las cepas de Escherichia coli conservadas en la Colección del Centro de Ingeniería
Genética y Biotecnología. Vaccimonitor, 19(1), 9-15.
• Verificación de la pureza microbiológica mediante crecimiento en placa de medios
indicadores
La pureza de los bancos de cepas habitualmente se confirma por siembra en placas Petri
sobre superficie de medios agarizados.
De cada banco se realizan diluciones seriadas en solución salina y se siembran por el

método trazas de dilución sobre diferentes medios: LB, Agar Mac Conkey, Agar Eosina Azul
de Metileno, Agar Citrato de Simmons y Agar Triptona Soya
Como criterio de pureza microbiológica se considera la morfología de las colonias y sus

habilidades de crecimiento en los diferentes medios de cultivo, así como la homogeneidad de
las células por tinción de Gram
• Verificación de fenotipos de vías sintéticas, degradativas y resistencia a
antibióticos
En las algunas cepas mutantes ( como de E. coli) la

verificación de los genotipos es fundamental para garantizar
el mantenimiento de los marcadores bioquímicos y poder
detectar posibles reversiones que puedan afectar los resultados
en el proceso investigativo. Esta verificación valida que cada
mutante mantiene los marcadores por los cuales ha sido
almacenado y que lo hace útil en el trabajo en biología
molecular.
• Reacción en cadena de la polimerasa
Ya que una de las prácticas habituales para la obtención de cultivos puros es
partir de una colonia, se corre el riesgo si el cultivo está contaminado con
una cepa ambiental de E. coli, de seleccionarla como la cepa de interés..
En el caso de cepas protótrofas son indistinguibles de estos contaminantes

por todos los métodos convencionales de verificación de pureza.
Debido a esto se emplea la RCP para autentificar el serotipo al cual

pertenece la mayor cantidad de cepas de la colección.
• Estrategia de verificación
Una vez realizadas las diferentes pruebas a todos los bancos de la colección se establece una
estrategia única de verificación de los bancos.
Los métodos de chequeo para la verificación de la pureza y la estabilidad de las cepas de interés
biotecnológico posibilitan la caracterización y el chequeo de un gran número de bancos con el
empleo de un mínimo de tiempo, manipulación y con criterios únicos de autenticación.
El diseño de estrategias propias desarrolladas en el laboratorio garantiza que las cepas de la

colección mantengan los marcadores moleculares que las hacen útil para el trabajo biotecnológico y
posibilita que los resultados inter-laboratorios sean comparables.
Ejemplo de una estrategia general para el
chequeo y aprobación de los bancos de cepas de
E. coli de la Colección de Microorganismos de
interés biotecnológico del CIGB.
Unidad 2.- Principios de ingeniería
biosintética.
Tema 2.1.- Definición y principios de la
ingeniería biosintética.
Ingeniería biosintética (aspecto conceptual)
Es el campo que involucra la construcción,

redirección y manipulación del metabolismo
celular a través de la alteración de las actividades y
niveles de enzimas endógenas y / o heterólogas
para lograr la biosíntesis o biocatálisis de las
moléculas deseadas
Comba, S., Arabolaza, A., & Gramajo, H. (2012). Emerging engineering principles for yield improvement in microbial cell design. Computational and structural biotechnology
journal, 3(4), e201210016.
Las primeras aplicaciones de la ingeniería biosintética se limitaron a metabolitos nativos
como:
aminoácidos
ácidos antibiotic
orgánicos os
alcoholes
journal, 3(4), e201210016.
El diseño de una fábrica celular requiere…
Comprensión cuidadosa de las reacciones metabólicas involucradas en la

síntesis de un producto objetivo
Consideración de los elementos reguladores que afectan el rendimiento

metabólico
Análisis de la interconexión del metabolismo celular.
journal, 3(4), e201210016.
Aporte de las tecnologías ómicas en el progreso de la ingeniería biosintética
Mejoras en la secuenciación del genoma y las tecnologías de síntesis de ADN
Expansión de bases de datos de expresión génica, reacciones metabólicas y

estructuras enzimáticas
Generación de nuevas herramientas genéticas para ejercer un control estricto

sobre vías metabólicas
creación de nuevos métodos analíticos para detectar y cuantificar ARN, proteínas

y metabolitos celulares
Creación de modelos biológicos detallados que ayuden al diseño de enzimas y

vías metabólicas
El potencial de la ingeniería biosintética podría ejemplificarse mediante:
se sintetizan a partir de:

 acetil-CoA
 propionil-CoA
 malonil-CoA
la producción  metilmalonil-CoA
heteróloga exitosa de
compuestos policétidos
La complejidad estructural de los policétidos impide el
desarrollo de rutas sintéticas químicas prácticas, dejando
la fermentación como la única fuente para la producción
de agentes farmacéuticamente y agrícolamente útiles
journal, 3(4), e201210016.
Los policétidos son ampliamente utilizados como
antibióticos
agentes inmunosupresores
Antitumorales
Antifúngicos
Antiparasitarios
journal, 3(4), e201210016.
Otras aplicaciones de la ingeniería biosintética
Producción de proteínas heterólogas
Creación de vías que conducen a nuevos productos
Degradación de xenobióticos
Ingeniería de fisiología celular para la mejora de

procesos
Eliminación o reducción de la formación de
subproductos
Mejora del rendimiento y la productividad.
journal, 3(4), e201210016.
Aspectos a considerar para mejorar la eficiencia de la formación del producto…
Factores de transcripción globales y

específicos
Las rutas metabólicas

naturales están controladas
por una serie de sistemas
Fuerza del promotor
reguladores como:
Regulación bioquímica de enzimas
Disponibilidad de sustrato
journal, 3(4), e201210016.
De importancia considerar que…
Rendimiento Productividad
Se requiere de la expresión
controlada de varios
genes naturales y/o
viabilidad heterólogos para evitar que
comercial los pasos de conversión limiten
el rendimiento del producto.
journal, 3(4), e201210016.
Tema 2.2.- Quimioinformatica.
Quimioinformatica (aspecto conceptual)
También conocida como informática

química, es la aplicación de métodos
computacionales para problemas
químicos, con particular énfasis en la
manipulación de la información
estructural.
Leach, A. R., & Gillet, V. J. (2007). An introduction to chemoinformatics. Springer Science & Business Media.
La quimio-informática ha aumentado, en
parte para lidiar con las enormes
cantidades de datos generados en
diversos campos de la química orgánica y
su aplicacion en la investigación
terapéutica.
La quimionformática como disciplina relativamente nueva
Inició con el procesamiento de documentos químicos y

publicados en The Journal of Chemical Documentation
(1961). Después fue renombrado como The journal of
Chemical Information & Computer Science (1974).
implicó el requisito de trabajar

con estructuras químicas
Algunos patrones comunes usados en
quimioinformática
Estructura de Markush o estructura genérica.
Este es un patrón topológico utilizado por los químicos durante muchos años. Es una forma eficiente de representar
un número ilimitado de compuestos con el mismo andamio.
Farmacóforo tridimensional
Este patrón se deriva, manual o computacionalmente, de un modelo molecular

tridimensional. El patrón se basa en un modelo físico y mecanismo de unión. Es
sensible a los cambios de conformación.
Los métodos de regresión son los enfoques más tradicionales para el reconocimiento de patrones. Estos métodos
suponen que las variables son continuas y las formas curvas están predefinidas.
Este enfoque se aplica cuando hay un gran número de descriptores y estos tienen varios tipos de valores y rangos.
Tema 2.3.- Obtención de terpenos mediante
Fischer, M. J., Meyer, S., Claudel, P., Bergdoll, M., & Karst, F. (2011). Metabolic engineering of monoterpene synthesis in yeast. Biotechnology and bioengineering, 108(8), 1883-
1892.
Los terpenos son una diversa
clase de compuestos orgánicos
derivados del isopreno (o 2-metil-
butadieno), un hidrocarburo de
5 átomos de carbono.
Estructura molecular simplificada del isopreno

Se usan en la industria alimentaria y farmacéutica.
La tendencia es hacia la ingeniería de

microorganismos modificados que producen altos
niveles de terpenoides específicos
La mayoría de los estudios se han centrado en crear

vías heterólogas específicas para sesquiterpenos en
Escherichia coli o levadura.
Clasificación de los isopropenoides con base al número de carbonos
Hemi-terpenos(C5)
mono-terpenos (C10)
Sesqui-terpenos(C15)
Di-terpenos (C20)
Tri-terpenos (C30)
Producción de terpenos de importancia económica a nivel industrial
sabores o fragancias
compuestos
para la industria de
bioactivos en
alimentos y
medicina con valores de
fragancias mercado de alrededor
de U$D 1 billon
La producción de terpenos no es sencilla por lo que
ahora tiende a realizarse mediante ingeniería de la vía
isoprenoide o por expresión heteróloga de varias
enzimas para reconstituir una vía isoprenoide parcial
Por ejemplo, las monoterpenos sintasas se han
estudiado menos que las sesquiterpenos sintasas y se ha
trabajado muy poco para optimizar las cepas de E. coli
o S. cerevisiae para generar un conjunto de geranil
difosfato (GPP) disponible que permita una producción
eficiente de monoterpeno
Se ha reportado que S. cerevisiae silvestre no
produce monoterpenos.
En la levadura, las actividades de GPP y farnesil

difosfato (FPP) sintasa son compartidas por una
enzima llamada farnesil difosfato sintasa (FPPS).
FPP es precursor de metabolitos de levadura que se utilizan para
varias vías biosintéticas como las de ergosterol, dolicoles,
ubiquinona y hemo A.
No se ha asignado un rol específico a GPP además de ser un

precursor de FPP.
El gen FPPS es esencial para S. cerevisiae, ya que la disrupción

genética es letal
El gen FPPS de levadura codifica un polipéptido de 40.5 kDa de 342
aminoácidos con un alto grado de similitud con FPPS de otros organismos
La FPPS de la levadura cataliza la formación de la C15 FPP por dos reacciones

de condensación secuenciales de isopentenil difosfato (IPP) con dimetilalil
difosfato (DMAPP) en GPP, y luego GPP con otra molécula de IPP en FPP
La necesidad de FPPS para la supervivencia de la levadura y la capacidad de la

enzima para producir solo FPP dejaron poco espacio para la mejora tecnológica
Sin embargo, fue posible aislar un mutante de levadura que exhibía una
actividad específica de FPPS 14 veces menor
El gen mutado erg20-2 mostró un solo cambio de nucleótidos, lo que resultó
en una sustitución de K197 en FPPS
Vale la pena señalar que K197 es un residuo altamente conservado entre FPPS
de diversos orígenes
Este mutante demostró que tiene varias propiedades inusuales, como excretar
alcoholes prenílicos, geraniol y linalool, y sintetizar dolicoles significativamente
más largos que la cepa de tipo salvaje FL100
Un conjunto adicional de mutaciones (K197R, K197E y K197V) ha
mostrado una correlación entre la actividad de FPPS, con la cantidad
de ergosterol sintetizado y el crecimiento celular
Sitio catalítico de FPPS. Posiciones K197. K 254. Los dominios FARM y SARM en el
sitio catalítico se muestran en color (A). Se detalla la interacción espacial de GPP y
Mg2þ con K197 y K254 en el sitio catalítico (B).
En un estudio se generó un conjunto de mutantes FPPS en la posición K197.
Se abordaron los siguientes puntos:
las propiedades de crecimiento de los mutantes en

comparación con la cepa original
cómo se relaciona el crecimiento de los mutantes

con el metabolismo del esterol.
el potencial de estas cepas en relación con la

producción de monoterpeno
cualquier información estructural sobre las

propiedades enzimáticas de FPPS
Este estudio mostró:
mostró que la mejor versión de FPPS se obtuvo del aminoácido de la

versión nativa K197.
Se demostró que la actividad de FPPS es suficiente para soportar el

crecimiento normal del mutante.
Se mostró que cualquier modificación en esta posición tiene un fuerte

efecto en el tiempo de duplicación de la levadura.
Tema 2.3.- Obtención de policetidos mediante
Mutka, S. C., Bondi, S. M., Carney, J. R., Da Silva, N. A., & Kealey, J. T. (2006). Metabolic pathway engineering for complex polyketide biosynthesis in Saccharomyces
cerevisiae. FEMS yeast research, 6(1), 40-47.
• Aspecto conceptual
Los policétidos son un grupo diverso de productos

naturales con importancia en medicina humana y
veterinaria. Debido a que los policétidos son moléculas
estructuralmente complejas y la fermentación es la ruta
de producción más comercialmente viable, es deseable
un sistema huésped heterólogo genérico para la
producción de policétidos de alto nivel.
• Aplicaciones terapéuticas de los policétidos
Cáncer (adriamicina),
Enfermedad infecciosa (eritromicina, tetraciclina),
Enfermedad cardiovascular (mevacor, lovastatina)
Inmunosupresión (siroluomus, tacrolimus)

• Síntesis de policétidos
Los policétidos son sintetizados por enzimas llamadas

policétido sintasas (PKS).
Estas enzimas catalizan la condensación repetitiva de los

precursores de acil-coenzima A (acil-CoA).
Un PKS 'modular' típico, como la desoxy-eritro-nolida
B sintasa (DEBS) de Saccharopolyspora erythraea, está
compuesto por varias cadenas de polipéptidos grandes,
funcionalmente organizadas desde el extremo amino al
carboxilo en un módulo de carga, múltiples módulos de
extensión y un liberando dominio.
Los PKS "iterativos" son más pequeños y están
compuestos por menos sitios activos que se usan varias
veces a lo largo de la ruta biosintética.
La complejidad estructural de los policétidos
generalmente impide la síntesis química para la
producción a gran escala.
La mayoría de los organismos productores de policétidos naturales no son
huéspedes óptimos para la producción de policétidos de alto nivel, ya que
tienden a crecer lentamente, producen niveles bajos de policétidos y, a
menudo, no son susceptibles de manipulación genética.
El enfoque final para la sobreproducción de policétidos sería desarrollar

un huésped genérico en el que los genes PKS y otros genes esenciales
pudieran transferirse y expresarse funcionalmente
Saccharomyces cerevisiae es un candidato ideal que cuenta con un

crecimiento relativamente rápido, herramientas genéticas altamente
desarrolladas y ciencia de fermentación avanzada.
• El rol de Saccharomyces cerevisiae en la síntesis de policetidos
S. cerevisiae es un excelente huésped de producción para un policétido

simple, produciendo 1,7 g de ácido metilsalicílico por litro de cultivo en
fermentaciones no optimizadas en matraces de agitación.
Una barrera para la producción heteróloga de policétidos complejos en S.

cerevisiae es la falta de vías de precursores de policétidos.
S. cerevisiae genéticamente modificado es capaz de producir niveles muy

altos de un policétido fúngico simple, ácido 6-metilsalicílico (6-MSA).
• Desafios de de S. cerevisiae como huésped para la biosíntesis compleja de policétidos
La producción de policétidos requiere la expresión heteróloga de grandes genes G1Crich PKS.
Dado que el uso de codones de levadura está más orientado hacia A+T y que la mayoría de los
productores de policétidos tienen genomas altamente ricos en G+C, la levadura puede tener niveles
insuficientes de algunos ARNt necesarios para la expresión del gen PKS
La expresión heteróloga de PKS y genes auxiliares puede requerir optimización de codones y / o

suplementación de agrupaciones endógenas de tRNA.
S. cerevisiae no tiene una fosfo-pante-teinil transferasa endógena adecuada capaz de la necesaria

modificación postraduccional de los dominios ACP de la PKS.
La expresión funcional de la PKS fúngica, 6-MSAS, requiere la
expresión heteróloga de Sfp para la actividad.
La levadura no produce algunos de los precursores de policétidos de

acil-CoA necesarios, como metilmalonil-CoA.
Para la producción de policétidos más complejos, las rutas de acil-

CoA endógenas pueden no ser suficientes, y la expresión de rutas de
acil-CoA heterólogas puede ser necesaria para producir niveles
adecuados de sustratos.
Vías para la biosíntesis de propionil-CoA y metil-malonil- CoA
Para la producción de metilmalonil-CoA
dependiente de propionil-CoA, se ha
empleado la Salmonella typhimurium
propionil-CoA sintetasa (PrpE) para
catalizar la producción de propionil-CoA
a partir de propionato (incluido en el
medio de producción) y ATP endógeno.
Tambien se ha empleado la vía propionil-CoA
carboxilasa (PCC) de Streptomyces coelicolor que
consiste en la subunidad transcarboxilasa, PccB, y
la subunidad proteína transportadora de biotina /
biotina carboxilasa, AccA.
Mediante ingeniería biosintetica de S. cerevisiae, se
ha demostrado la producción in vivo de
metilmalonil-CoA de las vías PCC y MatB.
Tema 2.4.- Obtención de péptidos ribosomales
y no ribosomales mediante ingeniería
biosintética.
Tema 2.4.- Ingeniería biosintética
combinatoria.
• Aspecto conceptual
La biosíntesis combinatoria se puede definir como

la aplicación de la ingeniería genética para
modificar las vías biosintéticas de los productos
naturales con el fin de producir estructuras nuevas
y alteradas utilizando la maquinaria biosintética de
la naturaleza.
• Antecedentes
La viabilidad de este enfoque se demostró por primera vez al seguir la
clonación de genes biosintéticos para el antibiótico actinorodina de
Streptomyces coelicolor ( por Hopwood, en 1984),
Hopwood y colegas clonaron estos genes en productores de antibióticos

medermicina y di-hidro-granaticina respectivamente.
El transformante del productor de medermicina (Streptomyces sp. AM-

7161) produjo grandes cantidades de un nuevo compuesto: la
mederrodina A (figura 1)
El transformante del productor de di-hidro-grana-
ticina, Streptomyces violaceoruber Tu 22 produjo
un nuevo compuesto, dihidrogranatirodina.
Fig. 1. Primera demostración de
ingeniería genética de productos
naturales híbridos, mederrodina A y
di-hydro-grana-tiro-dina
El transformante del productor de dihidrogranaticina,
Streptomyces violaceoruber Tu 22 produjo un nuevo
compuesto, dihidrogranatirodina, que tiene la configuración de
actinorodina en uno y la configuración de dihidrogranaticina en
el otro estereocentro del sistema de isocromano quinona.

Biosintesis de Farmacos

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Doctorado en Ciencias en Química Aplicada

Asignatura: Biosíntesis de Fármacos

Profesor: Dr. en C. Miguel A. Vilchis-Reyes

Estudiante: M. en C. Eduardo De la Cruz-Cano

Cunduacán, Tabasco. Agosto, 2019

• Okafor, N. (2016). Modern industrial microbiology and biotechnology. CRC Press.

Las características del producto • Indicará dónde tomar las

• Indicara cómo diseñar los

• Okafor, N. (2016). Modern industrial microbiology and biotechnology. CRC Press.

Velocidad de crecimiento alta.

De fácil conservación por largos períodos de tiempo.

Deberá llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo corto

De fácil extracción del medio de cultivo.

• Okafor, N. (2016). Modern industrial microbiology and biotechnology. CRC Press.

Preservar la pureza genética del cultivo sin pérdida de ninguna de

Preservar los niveles de su productividad inicial

Lograr que el cultivo pueda ser transportado (fácil manejo).

• Okafor, N. (2016). Modern industrial microbiology and biotechnology. CRC Press.

• Okafor, N. (2016). Modern industrial microbiology and biotechnology. CRC Press.

• Okafor, N. (2016). Modern industrial microbiology and biotechnology. CRC Press.

• Okafor, N. (2016). Modern industrial microbiology and biotechnology. CRC Press.

Es una técnica de elección para cortos o largos períodos de tiempo

Las células a congelar pueden ser resuspendidas directamente en un agente

• Okafor, N. (2016). Modern industrial microbiology and biotechnology. CRC Press.

1. La tierra estéril se inocula con un cultivo y se incuba varios días para

2. Posteriormente, la tierra es secada (desecador) y el cultivo mantenido

3. Utilizado ampliamente en hongos y actinomycetes.

• Okafor, N. (2016). Modern industrial microbiology and biotechnology. CRC Press.

Involucra el congelamiento de un cultivo seguido por un secado al vacío, lo

Apropiada para la conservación de bacterias Gram-positivas, esporas,

No es adecuada para células animales y hongos en fase de micelio.

• Okafor, N. (2016). Modern industrial microbiology and biotechnology. CRC Press.

Mutación inducida Recombinación genética

• Okafor, N. (2016). Modern industrial microbiology and biotechnology. CRC Press.

Consiste en la observación de las características morfológicas de las colonias, el cual permite

Involucra la etapa de crecimiento seguida por ensayos de evaluación.

• Okafor, N. (2016). Modern industrial microbiology and biotechnology. CRC Press.

Implica: Agentes mutágenos Físicos Agentes mutágenos Químicos

• Okafor, N. (2016). Modern industrial microbiology and biotechnology. CRC Press.

Entre especies. El intercambio Bacterias. Se emplean para el

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Enzimas de restricción. Reconocen y cortan el ADN en sitios bien

Plásmidos. son moléculas de ADN circulares, originalmente aisladas de

• Okafor, N. (2016). Modern industrial microbiology and biotechnology. CRC Press.

Vectores de clonación. Son aquellos cuyo objetivo es el almacenamiento y obtención de grandes

• Okafor, N. (2016). Modern industrial microbiology and biotechnology. CRC Press.

Deberá ser pequeño

De fácil preparación y replicación en la célula huésped

No generar productos tóxicos para la misma

• Okafor, N. (2016). Modern industrial microbiology and biotechnology. CRC Press.

La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa

• Okafor, N. (2016). Modern industrial microbiology and biotechnology. CRC Press.

• Macronutrientes. Representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg

• Okafor, N. (2016). Modern industrial microbiology and biotechnology. CRC Press.

Medios sintéticos. Medios Medios complejos. Intervienen

• Okafor, N. (2016). Modern industrial microbiology and biotechnology. CRC Press.

• Okafor, N. (2016). Modern industrial microbiology and biotechnology. CRC Press.

Deben estar disponible para ser

• Okafor, N. (2016). Modern industrial microbiology and biotechnology. CRC Press.

Fuentes de carbono Fuentes de Nitrógeno