UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Faculdade

de Ciências Farmacêuticas, Alimentos e
Nutrição (FACFAN)

Disciplina:Biotecnologia
Doutoranda: Dhébora Albuquerque Dias
 • Applied Biochemistry and
Biotechnology

• A1

• Fator de impacto 2.140

• Disponível de 1976-2019

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 Clonagem, Expressão e Produção
de Xilo-Oligossacarídeos usando uma Xilanase Recém-Isolada de Rúmen Bovino

• São oligômeros de açúcares formados a partir da hidrólise da xilana, que é o principal componente da
hemicelulose das plantas.

Fig. 1 - Estrutura esquemática de xilose e xilo-oligossacarídeos. Adaptado: Carvalho et al. (2013).

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 Produção de Xilo-Oligossacarídeos

• demanda de prebióticos em todo o mundo;

• XOS a partir de diversas biomassas de plantas;

• Xilano a partir da biomassa agrícola, o XOS pode

ser produzido por métodos químicos.

Fig. 2 - Representação esquemática dos xilo-oligossacarídeos (XOS)

produção de biomassa cultural.

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 Fig. 3 Construção dos plasmídeos utilizados neste estudo. a e b: Xilanase recombinante que codifica xyl14 com 6His-tag no terminal C ou N, c e d:
Xilanase recombinante que codifica xyl02 com 6 His-tag C ou N- terminal .

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Ensaio de Proteína Total
Bradford utilizando o kit (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). A albumina de soro bovino (Sigma-Aldrich) foi
usada como padrão.

Ensaio Enzimático
• 35 ° C por 15 min, utilizando a mistura de ensaio padrão (0,5 mg / mL), que continha 1% de substrato
com a solução enzimática original (0,1 mg / mL, 0,1 mL) em tampão fosfato de sódio 50 mM. (pH 6,0).
Uma unidade de atividade enzimática em relação ao xilano foi definida como a quantidade de enzima
necessária para produzir 1 µmol de açúcares redutores por minuto.

Efeitos do pH, Temperatura e Especificidade do Substrato na Atividade

Enzimática
• cerca de 2 U foram incubadas com 1% de xilana;
• pH, temperaturas (pH 4.0 a 10);
• tampões de acetato de sódio, fosfato e Tris – HCl 50 mM;

• Os oligossacidos foram analisados por HPLC

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 Isolamento dos Genes Codificando Xilanase

6. Clonagem e Expressão de Xilanase

Recombinante em E. Coli:
1. Xyl02
xyl14 - xyl02 e xyl14
- os fragmentos de ADN que codificam xil14 e
xil02 fundidos com um marcador de seis
resíduos de histidina no terminal N ou C foram
2. Rumén do
5. GenBank boi obtidos por amplificação por reação em cadeia
(screening) da polimerase (PCR).

7. Cultura para a Produção de Xilanases

Recombinantes em E. Coli.

4. Positivos
xilanases azul 3. Genes
de tripano em
placas de ágar clonados de
contendo E.coli
xilano

7
 Tabela 1 Oligonucleotídeos utilizados neste estudo para a construção de xilanase recombinante

Adicionar título de slide

–4

8 03/02/2020 Adicionar um rodapé

 Adicionar título de slide
–5

Fig. 4 Cromatograma de HPLC obtido após reação enzimática

em diferentes valores de pH, a 35 ° C por 30 min. Métodos
analíticos detalhados são descritos em Materiais e métodos
Fig. 2 SDS-PAGE da xilanase recombinante. a 6H–xyl14. b xyl14-6H. c 6H–xyl02. d
xyl02-6H. M: marcador proteico padrão; 1: fração total antes da indução; 2: fração total
após indução a 37 ° C; 3: fração insolúvel após indução a 37 ° C; 4: fração solúvel após
indução a 37 ° C; 5: fração total antes da indução a 25 ° C; 6: fração total após indução a
25 ° C; 7: fração insolúvel após indução a 25 ° C; 8: fração solúvel após indução a 25 ° C

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 Fig. 5 Cromatograma de HPLC obtido após reação enzimática a diferentes
temperaturas a pH 6,0 por 30 min. Métodos analíticos detalhados são descritos em
Materiais e métodos
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Fig. 6 Cromatograma de HPLC obtido após reação
enzimática em diferentes concentrações a 35 ° C, pH 6,0
por 30 min. Métodos analíticos detalhados são descritos
em Materiais e métodos
11 03/02/2020 Adicionar um rodapé
 Referências
A.K. Samantan, Natasha Jayapal,C.Jayaram,SohiniRoy, A.P.Kolte, S. Senani,Manpal Sridhar . Xylooligosaccharides as prebiotics from agricultural by-
products: Production and applications. Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre, 2015.

AFA Carvalho, P de Oliva Neto, DF Da Silva. Xylo-oligosaccharides from lignocellulosic materials: chemical structure, health benefits and production by
chemical and enzymatic hydrolysis. Food Research International. v. 51, p. 75-85, 2013.

12 03/02/2020 Adicionar um rodapé