EXPRESION DE

ANTIGENOS EN
PLANTAS
 • Ventajas
 Las plantas funcionan como
biofábricas.
 Son sistemas relativamente
baratos y requieren escasa
inversión en facilidades e
infraestructura.
 Se dispone de sistemas de
expresión integrativos (plantas
transgénicas) y no integrativos
(vectores virales).
 Las plantas son un vehículo
ideal para la vacunación por
vía oral.
 Presentan las ventajas de los
entornos de expresión
eucariotas.
 Los productos obtenidos están
libres de patógenos de
mamíferos.
 DNA sintético
 Actualmente, mediante síntesis química se obtienen
miles de fragmentos de ADN cada día. El factor clave
para la simplificación del procedimiento consistió en
lograr la síntesis en fase sólida, que es susceptible de ser
adaptada a una máquina automática. Las limitaciones de
esta técnica sólo permiten sintetizar directamente
fragmentos de ADN de un tamaño menor a unas 100
bases, por lo que normalmente se les conoce como
oligonucleótidos (o simplemente oligos).

 De cualquier manera, utilizando las propiedades de

polimerización del ADN y de la enzima ADN ligasa, se
pueden construir grandes trechos de ADN de doble
cadena.
Síntesis química de oligonucleótidos

* Proceso cíclico en el que cada nucleótido es incorporado secuencialmente

(desde 3’ a 5’) para formar una cadena de nucleótidos.

* El nucleótido 3’ es covalentemente unido a un soporte sólido, y sobre el

se van añadiendo monómeros de uno en uno en un proceso que implica
cuatro reacciones químicas:

Detritilación
Acoplamiento
Capping
Oxidación

* El producto final contiene extremos 5’-OH y 3’-OH (no fosforilado).

Detritylation: The acid-labile DMT group of the support-bound monomer is removed with Dichloroacetic
acid (DCA) in order to get a free 5’- OH group.

Coupling: The 3’-end of the next nucleotide monomer is activated by tetrazole. Tetrazole, a weak acid,
protonates the tertiary nitrogen group of the phophoramidites so that the diisopropylamine moiety becomes
a good leaving group. The nucleophilic attack by the free 5’-hydroxyl group on the 3’phosphorous of the
incoming activated monomer results in a internucleotide binding.

Capping: The unreacted chains (failure sequences) must be capped to prevent further elongation in the
next cycles. For this step, acetic anhydride and N-methyl-imidazole are mixed to form an activated
acetylating agent.

Oxidation: The trivalent phosphate bond is oxidised with iodine to a more stable pentavalent bond. Steps 1
through 4 are repeated, beginning with the detritylation step, until the chain elongation is complete.
 TECNICA EN FASE SÓLIDA

 El DNA se sintetiza por un procedimiento en fase

sólida en el cual el primer nucleótido de la cadena se
sujeta a un soporte poroso por ej. gel de silice de 50mu
de tamaño; se necesitan varias etapas químicas para la
adición de cada uno de los nucleótidos, una vez cada
completada cada etapa la fase solida que contiene en
crecimiento se elimina de la mezcla de reacción por
filtración o centrifugación; una vez lograda la longitud
de DNA deseada se retira del soporte de fase sólida y se
purifica para eliminar los subproductos.
DiMetoxiTritil
Síntesis química de oligonucleótidos
(acido-labil)

5’-OH 3’-OH
C C G T A G C A
 TECNICA POR GRUPOS PROTEGIDOS
 Otro método consiste en la utilización de grupos protectores a
los extremos 3' o 5' de los mononucleotidos; estos grupos son
grandes residuos orgánicos que impiden la formación de
enlaces fosfodiestericos, pero que se pueden eliminar cuando
se desee.
 Si se condensa un nucleótido protegido en 5' con otro
protegido en 3' se formara un enlace fosfodiesterico normal
entre los extremos libres y aparecera un dinucleotido con
ambos extremos protegidos, dependiendo del lado al que se
desea incorporar un nucleótido el grupo protector se elimina
con un ácido o una base, se repite el ciclo de condensación,
eliminación de un grupo protector y recondensación hasta
conseguir la secuencia deseada.
TECNICAS PARA PREPARAR SONDAS

• Sondas de DNA:
• Técnica de Nick translation (corte-
sustitución)
• Técnica de Random Primer (marcaje al
azar)

• Sondas de RNA
• Técnica SP6 RNA polimerasa
Marcaje de ácidos nucleicos: Síntesis de DNA uniformemente marcado.

a) Nick translation b) Random priming

DNA duplex

Corte (nick)
1 Desnaturalización por calor
por DNAsa I
(10 ºC, 10 min)

+ Generación de cadenas simples

Actividad exo 5’-3’

2 de DNA pol. I
Unión de oligos (6-10 nt) “random”

5’ 3’ 5’ 3’

Incorporación dNTP marcados

3 dNTP por act. polimerasa Extensión mediante Klenow
de DNA pol. I 5’ 3’ 5’ 3’

Generación de fragmentos
Marcados (150-200 nt)
5’ 3’
c) Mediante PCR
 Nick - Translation (corte - sustitución) :
Sondas DNA.
5’ 3’ nicked DNA duplex
3’ 5’
E. coli DNA polymerase I
+
4 dNTPs (a32P-labelled)

PPI
* P OH
Pa O
Pb H
Pn
B
B
EXONUCLEOLYSIS
P
5' P P P OH P 3'

B B B B B B
B B B B B B

3' P P P P P 5'

Continued reaction
5’ 3’
3’ 5’ Labelled, nicked DNA duplex
 Randon Primer (Marcaje al azar) : Sondas DNA
Duplex DNA

Denature
Single strands
+
Add random
sequence primers
Single strand
+ random primers
Add klenow polymerase unlabelled
dNTPs labelled dCTP (*)
Primer extension
* * * *
Denature to
Template single release labelled probe
strand

Labelled probe * * * *

Add to hybridization mix

 Sistema SP6 - RNA polimerasa : Sondas RNA

Promotor SP6
Secuencia
de la Sonda
Sonda insertada
GEN vector
secuencia

plasmido
Linearizado

Adición SP6 RNA polimerasa

No marcado CTP, ATP, GTP
marcado UTP

Sondas
RNA
 BIOTINA  Biotina - Avidina
BIOTINA
(Sondas frias) : Sondas
DNA
Adición avidina

BIOTINA AVIDINA

BIOTINA AVIDINA

Adición biotina fosfatasa alcalina

BIOTINA AVIDINA Biotina fosfatasa alcalina

BIOTINA AVIDINA Biotina fosfatasa alcalina

Add nitroblue tetrazolium + bromo-chloro-indolyl

(NBT) phosphate(BCIP)

NBT
(BCIP) BCL
Insoluble
phosphate blue dye
REQUERIMIENTOS
- Sonda : Secuencia específica del agente patógeno
- DNA blanco : DNA de las muestras a analizar
(paciente)
- Señal de detección : marcaje de la sonda

EL USO DE SONDAS EN EL Dx OFRECEN

Especificidad : Producen respuesta a partir de un
solo organismo o molécula.
Sensitividad : Identifican pequeñas cantidades del
patógeno aún en presencia de otros patógenos.
Simplicidad : Desarrollo kits comerciales para
patógenos humanos, contaminantes de alimentos, etc.
Dx bacterias, virus, parásitos.
 SOUTHERN BLOTT NORTHERN BLOTT

 Extracción DNA  Extracción RNA

 Cortar con Enz. Restricción  ----------
 ------------  Denaturación con formaldehido
 Corrida Electroforética  Corrida Electroforética
(Usualmente agarosa) (Usualmente agarosa)
 Denaturación del DNA por  ----------
tratamiento alcalino
 Transferencia a N.C.  Transferencia a N.C.
(Usualmente por capilaridad) (Usualmente por capilaridad)
 Hibridación con la sonda  Hibridación con la sonda
marcada marcada
 Lavar exceso de la sonda  Lavar exceso de la sonda
 Detección Hibridación  Detección Hibridación
- Autoradiografía - Autoradiografía
- R. Color (sondas frias) - R. Color (sondas frias)
-
La técnica de Southern blot
 NORTHERN BLOT
* Interacción RNA-DNA (hibridación)
* Detectar en una mezcla una secuencia de RNA concreta mediante el uso de
sondas de DNA específicas (muy sensible)
* Expresión génica
1. Electroforesis en gel de agarosa
3. Hibridación con la sonda radioactiva
2. Transferencia a membrana
Sonda
moléculas de DNA 32P
moléculas de RNA
de RNA …TAACGT…
RNA
…AUUGCA… interés

Resultado
Gel Agarosa Northern BLOT
4. Revelado

RNA
interés
32P e-

Todos los RNA

RNA de interés
SECUENCIACION DE DNA
 Métodos

Hay dos métodos principales:

 􀁦 Metodo Quimico o de Maxam-Gilbert

 􀁦 Metodo Enzimatico o de Sanger
(secuenciación dideoxy o terminación de
cadena)
Método Químico o MÉTODO DE MAXMAN &
GILBERT
 Esta basado en la desestabilización mas o menos
selectiva de las bases nitrogenadas ante un determinado
reactivo químico; asi por ej.
 El dimetil sulfato desestabiliza y rompe en G;
 la hidrazina a altas concentraciones de NaCl rompe en
C, en medios ácidos rompe en A, G.

 De tal manera que si las condiciones son fijadas para

que solo 1 o máximo 2 sitios sean rotos al azar se
obtendrá una muestra heterogénea de diferentes
tamaños de DNA.
 Un fragmento de ADN se marca radiactivamente en
sus extremos con gamma 32P.
 La técnica consiste en romper estas moléculas marcadas
con reacciones químicas específicas para cada una de las
cuatro bases.
 Cuatro alícuotas de la misma muestra se tratan bajo
condiciones distintas, posteriormente el tratamiento
con piperidina rompe la molécula de ADN a nivel de la
base modificada.
 Los productos de estas cuatro reacciones se resuelven
en función de su tamaño en geles de poliacrilamida
donde la secuencia puede leerse en base al patrón de
bandas radiactivas obtenidas.
 SECUENCIACIÓN DEL DNA
* Método del didesoxi de Sanger – método de la
interrupción controlada de la reacción enzimática (de la
polimerización de DNA).
Frederick Sanger
* Elementos necesarios:

- DNA polimerasa

- Oligonucleótido (primer o cebador):

• 18-30 nucleótidos.
• complementario a una parte de la secuencia del DNA que queremos
secuenciar

- Mezcla de los 4 desoxinucleótidos (dATP, dCTP, dGTP y dTTP)

- Una pequeña cantidad de cada uno de los 4 didesoxinucleótidos

(ddATP* o ddCCTP* o ddGTP* o ddTTP*) marcados radioactivamente (*)
Este método utiliza los didesoxirribonucleótidos,
análogos de base que han perdido su grupo
alcohol OH del carbono 3'.
 SECUENCIACIÓN DEL DNA

* Reacción de la polimerasa:

Enlace fosfodiéster entre 3’-OH

de la cadena cebadora y P del
dNTP (liberación de PPi).

Desoxi nucleótido Didesoxi nucleótido

(bloqueo de la síntesis de DNA)

OH
dNTP
 Este método emplea análogos de bases (ddNTPs), que
carecen de OH en la posición 3' pero si presentan el
fosfato en 5',y sirven de sustrato de la DNApolimerasa
I para unirse a la cadena de DNA que esta siendo
sintetizada; pero dado que el análogo es incapaz de
formar un enlace fosfodiester con dNTP normal, la
síntesis del DNA se detiene cuando se incorpora un
ddNTP, pero como además de los ddNTPs la reacción
se incuba con los 4 dNTPs normales la interrupción de
la sintesis del DNA ocurre al azar.
 El procedimiento consiste en preparar 4 alicuotas de la
cadena de DNA a secuenciar marcado con P32 en uno
de sus extremos; a los cuales se adiciona DNA
polimerasa I, 4dNTPs y 1 ddNTP.

 Los fragmentos resultantes de la síntesis de las nuevas

cadenas se separan por tamaños en electroforesis en gel
de poliacrilamida y por auto radiografía se lee
directamente las bandas de secuenciamiento de DNA.
 SECUENCIACIÓN DEL DNA

- Método antiguo

- Nucleótidos marcados con 32P

- 4 tubos de reacción
(1 para cada ddNTP)

- Lectura: electroforesis
y autorradiografía
 SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA
EMPLEANDO EL METODO
ENZIMÁTICO
 Es una alternativa al método de Sanger. Consiste
en marcar el oligo cebador o los terminadores
con un compuesto fluorescente y activar la
reacción de secuencia. Los productos de la
reacción se detectan directamente durante la
electroforésis al pasar por delante de un láser
que al excitar los fluoróforos permite detectar la
fluorescencia emitida.
 Secuenciación empleando terminadores
fluorescentes

 Se realiza una única reacción de secuencia en

presencia de los cuatro ddNTPs, cada uno de
ellos marcados con una sonda fluorescente
distinta.
 SECUENCIADORES AUTOMÁTICOS
o Secuenciadores automáticos capilares
o Secuenciación automática en geles
desnaturalizantes de acrilamida/bisacrilamida
 SECUENCIACIÓN DEL DNA
- Secuenciador automático (detección por fluorescencia)
- Usa 4 ddNTPs unidos a una molécula fluorescente (de diferente color para cada uno)
- Una única reacción
- Lectura: electroforesis en gel capilar, láser + detector fluorescencia (automatizado)


 Secuenciación de DNA (automática en gel)

a) Reacción de secuenciación b) Análisis de la reacción

Secuenciación de DNA (automática en capilar)
 SECUENCIACION DE DNA
Secuenciador
automatico
 MICROARRAYS DE DNA
* Permiten comparar patrones de expresión entre dos estados celulares
(p.ej. normal-patológico, entre tipos celulares, entre diferentes fases
del desarrollo, en respuesta a un estímulo…)

Microarray o microchip:
Superficie con
diferentes secuencias
conocidas de DNA
inmovilizadas (cada
punto se corresponde
con un determinado
gen)
MICROARRAYS DE DNA
Microarrays de DNA
 PCR
Introducción:

* Polymerase Chain Reaction (reacción en cadena de la polimerasa)

* Amplificación in vitro de secuencias de DNA de hasta 10 kb. A partir de

una copia se pueden obtener millones en pocas horas.

* Es necesario conocer la secuencia de las regiones colindantes al fragmento

de DNA que se pretende amplificar.

Aplicaciones:

* Clínicas: - diagnóstico de enfermedades infecciosas y parasitarias:

detección de bacterias, virus y parásitos (p. ej. Leishmania,
tuberculosis, VIH…)
- diagnóstico de cáncer (mutaciones en genes ras, detección
de leucemias causadas por reorganización de cromosomas)

* Medicina forense y legal: parentescos biológicos, esclarecimiento de

crímenes…

* Clonaje de DNA y mutagénesis dirigida

 TAQ-POLIMERASA
1976: Thermus aquaticus  1988: polymerase chain reaction (PCR)

Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a

thermostable DNA polymerase.
Science. 1988, 239(4839):487-91

Máxima actividad catalítica sobre 75-80 ºC.

(Taq polimerasa sólo 10% activ. a 37 ºC)

Muy utilizadas en reacciones de PCR

y secuenciación de DNA
 PCR
* Elementos necesarios para la PCR (mezcla de reacción):

- DNA que queremos amplificar (DNA molde)

- 2 oligonucleótidos (~20 nucleótidos) que
hibriden en regiones flanqueantes al fragmento
de DNA a amplificar (primers, cebadores o
iniciadores)
- DNA polimerasa termoestable
- Nucleótidos (dNTPs)
- Cofactor: MgCl2
- Tampón de PCR

* Termociclador  Repetir ciclos (unos 30) de:

1. Desnaturalización  94 ºC
2. Annealing  50-60 ºC
3. Elongación  72 ºC
 La temperatura de hibridación:
 La temperatura de hibridación elegida para la PCR es
genralmente igual ó superior en 2 à 3°C a la
temperatura de fusión del oligonucleótido ( Tm ó
melting temperature). Una manera calcular ésta
temperatura es la siguiente:
 Tm = 2°C x (número de bases A, T) + 4°C x (número
de bases G, C)
 eJ : oligo CTC.AGA.ACC.ACC.GAG.CCC

 Tm = 4°C x 12 G,C + 2°C x 6 A,T = 48 + 12 = 60°C

Polymerase chain reaction (PCR)

EL PRODUCTO FORMADO A PARTIR DE LA PCR SE PUEDE LLAMAR

AMPLICON. ES ESPECIFICO Y SOLO DEBE VERSE UNA BANDA POR
AMPLIFICACION CON PRIMERS ESPECIFICOS.
Polymerase chain reaction (PCR)
CONCEPTOS BASICOS:

 ESPECIFICIDAD: GENERACION DE UN UNICO PRODUCTO DE

AMPLIFICACION

 EFICIENCIA: MAXIMA PRODUCCION DE AMPLIFICACION EN

FUNCION DEL NUMERO DE CICLOS

 FIDELIDAD: NUMERO DE ERRORES QUE COMETE LA DNA

POLIMERASA DURANTE LA COPIA

 SENSIBILIDAD: MINIMA CANTIDAD DE DNA QUE SE NECESITA

PARA OBTENER UNA GRAN CANTIDAD DE COPIAS
Polymerase chain reaction (PCR)
PCR

1000000
100000
10000

Nº pb
1000
100
10
1

25

40

50

60
0
Nº ciclos
Cinética de una reacción de PCR

Ct. (Cycle Thereshold). Primer ciclo

donde se detecta la señal procedente
del proceso de amplificación

Higuchi et.al. (1992).

 FILIACION
VARIABILIDAD GENETICA DE LA ESPECIE HUMANA

POLIMORFISMO GENETICO EN LA POBLACION

LOS POLIMORFISMOS SON DIFERENTES FORMAS DEL MISMO ALELO

EN LA POBLACION

LA FRECUENCIA DE LOS ALELOS RAROS DEBEN AL MENOS SER DEL

0.01 PARA SER CONSIDERADAS POLIMORFISMOS Y NO UNA
MUTACION RECURRENTE

LOS ALELOS DEL GRUPO DE SANGRE ABO SON EJEMPLOS

GENETICOS DE POLIMORFISMO
 FILIACION
EL TERMINO POLIMORFISMO HA SIDO DEFINIDO POR VOGEL

EN 1986

COMO EL RASGO MENDELIANO QUE EXISTE EN LA POBLACION

EN POR LO MENOS DOS FENOTIPOS,

NINGUNO DE LOS CUALES OCURRE CON UNA FRECUENCIA

MENOR AL 1%

SE HEREDA COMO UN RASGO MENDELIANO

 FILIACION

1 INDIVIDUO: 2 ALELOS POR GEN

POBLACION: HAY POLIMORFISMO PARA LOS ALELOS

EN LA POBLACION LOS INDIVIUOS PUEDEN PRESENTAR DIFERENTES

POLIMORFISMO QUE DAN LUGAR A DIFERENTES FENOTIPOS

EN LA POBLACION EXISTE UN ELEVADO NUMERO DE GENES QUE

PRESENTAN POLIMORFISMO = QUE TIENEN GRAN NUMERO DE
DISTINTOS ALELOS = QUE TIENEN ALELOS CON DISTINTA SECUENCIA
DE NUCLEOTIDOS
 FILIACION

EL GENOMA HUMANO CONTIENE 3,2 x 109 PARES DE BASES (ADN)

EL 10% REPRESENTA UN TOTAL DE APROXIMADAMENTE 70.000
GENES

EL RESTO DEL ADN SON SECUENCIAS NO GENICAS QUE:

MANTIENEN LA ESCTRUCTURA DEL ADN,
SON REGULATORIAS (PERMITEN LA TRANSCRIPCION),
SON SECUENCIAS REPETIDAS
 FILIACION

SECUENCIAS REPETIDAS

ALGUNAS DE ELLAS SON REPETICIONES DE 2 NUCLEOTIDOS:

(CA)n --- (GT)n

(CT)n --- (GA)n

SE LLAMAN MICROSATELITES DE DINUCLEOTIDOS

ELLAS PRESENTAN POLIMORFISMO PARA n EN DIFERENTES

INDIVIDUOS,
PUEDEN SER UTILIZADAS COMO MARCADORES GENETICOS
 FILIACION
ESTUDIOS DE FILIACION

SE ANALIZA EL PATRON DE 4 A 5 MARCADORES

MICROSATELITES DINUCLEOTIDOS POR INDIVIDUO

SE UTILIZA UNA TECNICA QUE PERMITE VISUALIZAR EL

SEGMENTO DE ADN QUE TIENE ESTOS MARCADORES

PARA EL ESTUDIO DE PATERNIDAD SE DEBE TOMAR LA MUESTRA DE LA
MADRE, HIJO Y POSIBLE PADRE

SE REALIZA LA TECNICA DE PCR PARA EL LOCUS D1S80 (marcador

microsatélite Dinucleotido del cromosoma 1 Satelite No 80)

CROMOSOMA 1 ----------------- 7 REPETICIONES

PCR PARA EL MARCADOR




CROMOSOMA 1 ------------------------------- 3 REPETICIONES

PCR PARA EL MARCADOR




CADA UNO ES UN ALELO DIFERENTE ENTRE INDIVIDUOS

 FILIACION
LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS PARA EL LOCUS D1S80 VAN DE 375
PARES DE BASE A 850 PARES DE BASES.
ESTA DIFERENCIA DE TAMAÑO SE PUEDE VER EN LA
ELECTROFORESIS Y ASIGNAR LOS ALELOS PARA CADA INDIVIDUO
DIRECTAMENTE

EL TRABAJO SE REALIZA EN DOS DIAS:

DIA 1: SE OBTIENEN LAS MUESTRAS Y SE REALIZA LA TECNICA PCR

DIA 2: SE REALIZA LA ELECTROFORESIS Y SE VISUALIZA EL

RESULTADO

SE VISUALIZA POR ELECTROFORESIS

FILIACION
 TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

ADN / ARN

CON AMPLIFICACIÓN / SIN AMPLIFICACIÓN

DIAGNÓSTICO clínico

IDENTIFICACIÓN bacteriana

ESTUDIOS DE RESISTENCIAS

FINES EPIDEMIOLÓGICOS
INDICACIONES DE LOS MÉTODOS DE BIOLOGIA MOLECULAR EN EL
DIAGNÓSTICO DE LA TUBERCULOSIS

CONFIRMA M. TUBERCULOSIS EN MUESTRAS BAAR POSITIVAS

DIAGNÓSTICO RÁPIDO EN MUESTRAS RESPIRATORIAS BAAR NEGATIVAS

DIAGNÓSTICO RÁPIDO DE CASOS DIFÍCILES

( MENINGITIS, - TB DISEMINADA EN PACIENTES CON SIDA)
MÉTODOS DE BIOLOGIA MOLECULAR EN LA IDENTIFICACIÓN DE LAS
MICOBACTERIAS

PCR : IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE MYCOBACTERIUM

por amplificación
de FRAGMENTOS DE ADN CONSTANTES
Y ESPECÍFICOS DE ESPECIE

EJEMPLOS: Frag. IS6110 específico del complejo M. tuberculosis.

RD1.RD2 Y ETDR Específicos de M. BCG

De esta manera
combinando una PCR para los diferentes fragmentos
podemos identificar en 24-48 hs.
M. tuberculosis, M. bovis, M. BCG, M. avium y otros...
 IS 6110
M 1 2 3 4 M

600
500
400
300

200

100
 RD1

Útil para diferenciar MB-BCG de MTBC

M 1 2 3 4 5 6 M