BIOTECNOLOGIE

• Le biotecnologie sono tutte quelle

tecniche utilizzate (fin dall’antichità)
per produrre sostanze specifiche a
partire da organismi viventi o da loro
derivati.

• A metà del Novecento la biologia

molecolare offre gli strumenti per lo
sviluppo dell’ingegneria genetica.
 A cosa servono le
biotecnologie?

• ottenere prodotti utili ed innovativi

• migliorare le loro caratteristiche
originali
• per la ricerca di base
BIOTECNOLOGIE
TRADIZIONALI
• Sono tecnologie produttive utilizzate da
millenni, in:
• agricoltura, (selezione dei semi delle
piante con le caratteristiche migliori)
• zootecnia (selezione delle specie di
animali domestici)
• sfruttamento della fermentazione dei
microrganismi (vino, pane, birra, yogurt)
Pasteur (a partire dal 1857)
BIOTECNOLOGIE
INNOVATIVE
• L’avvento delle tecnologie del DNA
ricombinante (ingegneria genetica)
segna una linea di demarcazione fra
biotecnologie tradizionali e
biotecnologie innovative.

Herbert Boyer Stanley Cohen

Nel 1973 clonano la
prima molecola di DNA
CLONAGGIO
• Le biotecnologie si basano su molte
discipline scientifiche per ottenere
prodotti industriali diversi e innovativi
 Campi di applicazione delle
biotecnologie

• Tutela della salute (diagnostici, farmaci,

vaccini, cellule staminali, terapia genica,
monitoraggio ambientale e qualità degli
alimenti
• Produzione alimentare (OGM, MGM)
• Smaltimento dei rifiuti
SETTORI BIOTECNOLOGICI
• Blue biotechnology (o biotecnologie marine): è il
settore che si occupa di applicare le metodiche della
biologia molecolare agli organismi marini e di acqua
dolce.

• Grey biotechnology (o biotecnologie ambientali): è

il settore che si interessa di tutte le applicazioni
correlate all'ambiente.

• Green biotechnology (o biotecnologie

agroalimentari): è il settore delle biotecnologie che
si occupa dei processi agricoli.
• Red biotechnology (o biotecnologie farmaceutiche):
è il settore delle biotecnologie che si occupa
dei processi biomedici e farmaceutici.

• White biotechnology (o biotecnologie industriali):

è il settore delle biotecnologie che si occupa dei
processi di interesse industriale.

• Gold biotechnology (o bioinformatica): La

bioinformatica è una scienza multidisciplinare che
integra conoscenze informatiche,
chimiche, matematiche, mediche e
biologiche
• Consiste nel far crescere le cellule in
specifici contenitori di laboratorio o in
bioreattori in presenza di nutrienti
appropriati
• Non richiede interventi a livello
molecolare ed è quindi una tecnologia più
vicina alle biotecnologie tradizionali
TECNOLOGIA DEL DNA
RICOMBINANTE
È una tecnologia che permette di tagliare, modificare e
trasferire geni da una cellula all’altra (anche di specie
diverse).

Il DNA ricombinante viene utilizzato per:

- ottenere frammenti specifici di DNA

in grandi quantità
- studiare la sequenza di determinati
frammenti genici
- identificare particolari sequenze in
un cromosoma
- studiare le modalità di espressione e
regolazione genica
- creare piante o animali transgenici
- diagnosticare e curare malattie
genetiche
Lo spostamento di geni da una cellula all’altra è un fatto
che in natura avviene regolarmente.

Nei batteri tramite:

- CONIUGAZIONE
- TRASDUZIONE
- TRASFORMAZIONE

I microrganismi più usati nell’ingegneria genetica sono

BATTERI e VIRUS per

- semplicità di struttura
- rapidità di crescita
- facilità di purificazione dei prodotti
 Clonaggio genico
• Si definisce clonaggio un sistema per ottenere
molte copie di un tratto di DNA inserendolo in un
ospite mediante l’uso di vettori molecolari.

• TAPPE DEL CLONAGGIO:

1) Taglio del DNA con endonucleasi di restrizione
2) Unire due frammenti di DNA con DNA ligasi
3) Selezione di una piccola molecola di DNA in grado
di autoreplicarsi
4) Trasferimento del DNA ricombinante ad una
cellula ospite
5) Identificazione delle cellule ospite contenenti il
DNA ricombinante
 ENZIMI DI RESTRIZIONE
• Per tagliare il DNA vengono impiegati gli
enzimi di restrizione, che di solito i
batteri usano per frammentare il DNA
dei virus e bloccarne la replicazione.
Esistono molti enzimi di restrizione,
ognuno dei quali taglia il DNA in
specifiche sequenze di basi: ogni
sequenza è detta sito di restrizione (è
una sequenza palindromica di 4, 6, 8
coppie di basi azotate).
 Per esempio l’enzima EcoRI riconosce la
sequenza :

GAATTC
CTTAAG

e taglia il DNA di entrambi i filamenti tra le basi G e A; i due

filamenti si separano lasciando sporgere a ciascuna estremità una
sequenza singola.

GAATTC
CTTAAG

Siti di restrizione
• Gli enzimi di restrizione possono
effettuare due tipi di tagli:
Netti
Sfalsati (che tagliano in
maniera asimmetrica, creando
“estremità appiccicose”)
 PLASMIDI
• Frammenti di DNA a forma di anello che
si replicano indipendentemente dal
cromosoma batterico

DNA LIGASI
•Le DNA ligasi cuciono i frammenti
formando DNA ricombinante.
PLASMIDI
• Origine di
replicazione
(ori)
• 2 geni che
conferiscono
resistenza a
vari antibiotici
• Molte
sequenze di
riconoscimento
per diverse
endonucleasi di
restrizione
• Enzimi di restrizione = taglio al DNA
• DNA ligasi = Cucitura nei plasmidi
• VETTORI RICOMBINANTI (nei
batteri: trasformazione batterica)
TRASFORMAZIONE
La reazione a catena della
polimerasi (PCR)
• 1985 – Kery Mullis
• 1993 - Premio Nobel

Tecnica costituita da 3 fasi:

• Denaturazione
• Legame dei primers
• Sintesi di DNA
• La reazione a catena della polimerasi
(PCR) può creare in provetta molte copie
di un segmento di DNA assai rapidamente.
• La PCR richiede l’uso della DNA
polimerasi, l’enzima che si occupa della
duplicazione del DNA, e una fornitura di
nucleotidi per la formazione del nuovo
DNA.
• Elementi necessari per la PCR: DNA
contenente il segmento da amplificare,
Coppia di inneschi (o primers), TAQ
DNA POLIMERASI, dNTP, Mg2+,
Termociclatore
Taq DNA polimerasi

Taq DNA polimerasi

è una DNA
polimerasi
termostabile
prodotta dal
batterio termofilo
Thermus aquaticus
TERMAL CYCLER
REAL TIME PCR (RQ-PCR)
 Elettroforesi degli acidi
nucleici
• L’elettroforesi è una tecnica biochimica che
permette di separare le molecole dotate di
carica in base al loro diverso peso molecolare.
Le separazioni elettroforetiche vengono fatte
in gel.
• La matrice del gel può essere costituita da
• agarosio (range di separazione: 0.5-20 kb)
• poliacrilammide (range di separazione 10-500
bp)
ELETTROFORESI SU GEL
D’AGAROSIO
 SEQUENZIAMENTO
GENICO
• MAPPATURA GENETICA: rapprsenta la
distanza relativa tra geni ricavata dalla
probabilità che essi siano associati negli
incroci o in altre tecniche genetiche
analoghe
• MAPPATURA FISICA: si basa sulle
tecniche utilizzate in biologia molecolare
per costruire mappe che mostrano la
posizione fisica dei geni rispetto a
particolari sequenze di DNA
 SEQUENZIAMENTO DEL
DNA CON TERMINATORI O
METODO DI SANGER
• È possibile determinare la sequenza
nucleotidica di un segmento di DNA
tramite il metodo di Sanger, che
permette di sequenziare al massimo
700 coppie di basi; per porzioni più
lunghe il DNA viene tagliato in
frammenti più piccoli, che sono poi
analizzati separatamente
Il DNA viene tagliato con due
enzimi di restrizione
diversi. I frammenti ottenuti
sono sequenziati e
sovrapposti in modo da
determinare l’intera sequenza
nucleotidica; questo metodo è
oggi interamente
automatizzato
 LIBRERIA GENOMICA
• È una collezione di segmenti di DNA
provenienti dal genoma di un organismo,
ospitati in vettori ricombinanti
all’interno di cellule batteriche
• Comprende i cloni di tutto il DNA di un
organismo, DNA codificante e non, geni
espressi e non.
 LIBRERIA DI cDNA
• La copia a DNA di un mRNA viene detta DNA
complementare o cDNA. L’insieme dei cDNA
clonati viene detto libreria di cDNA.
• L’enzima trascrittasi inversa permette di
ottenere da ogni molecola di mRNA estratta
dal campione una copia di cDNA (DNA
complementare)
• I cDNA così ottenuti vengoni inseriti in
appositi vettori e introdotti nelle cellule
ospiti.
 PROGETTO GENOMA
UMANO
• Il Progetto Genoma Umano, portato a
termine nel 2003, ha sequenziato il
corredo cromosomico aploide di un
essere umano, che comprende oltre 3
miliardi di nucleotidi.
 BIOINFORMATICA
 La bioinformatica (informatica applicata alla biologia
molecolare) ha permesso di passare dallo studio di
singoli geni a quello dell’intero trascrittoma (è
l’insieme degli mRNA prodotti da un organismo, un
organo, un tessuto o una cellula in un dato stadio dello
sviluppo o sotto particolari condizioni ambientali e
fisiologiche e rappresenta l’espressione del genoma) e
proteoma (è l’insieme di tutte le proteine espresse in
un dato momento in un dato tessuto, in una cellula, in
un organulo).
 CLONAZIONE
• La clonazione in biologia è la
riproduzione agamica, naturale o
artificiale, di individui o cellule con
identico patrimonio genetico (cloni).
Esempi di processi clonogenici naturali
sono la scissione binaria dei batteri o la
mitosi delle cellule eucariotiche.
 CLONAZIONE DI INTERI
INDIVIDUI
• Per clonazione artificiale si intende la generazione di
un intero organismo a partire da una singola cellula
non zigotica.

• Questa tecnica permette di ottenere copie

geneticamente identiche dell’organismo di partenza e
trova applicazioni nella zootecnia (ad es. per
riprodurre animali dalle caratteristiche eccellenti
come cavalli da corsa, mucche da latte o tori da
riproduzione), ma anche nella conservazione
dell’ambiente (per esempio per ripopolare specie
animali in via di estinzione che non è possibile fare
riprodurre naturalmente in cattività).
 TRASFERIMENTO
NUCLEARE
La tecnica più diffusa è quella del trasferimento
nucleare:

1. Il nucleo aploide di una cellula uovo ricevente viene

sostituito con il nucleo contenente il genoma diploide
di una cellula somatica del donatore;
2. Lo pseudo-zigote (cellula uovo resa diploide non per
fecondazione con uno spermatozoo) dà origine a un
embrione, anche se il suo genoma deriva da una
cellula adulta (cioè differenziata);
3. L’embrione viene trasferito nell’utero di una
femmina della specie donatrice (madre surrogata);
4. La prole avrà il genoma identico (clone) a quello della
cellula somatica donatrice.
• Con questa tecnica è stata generata
nel 1997 la pecora Dolly, il primo
animale a essere clonato da una
cellula somatica.

La pecora Dolly nacque,

clonata, nel 1997 e visse
per sette anni, durante i
quali diede alla luce
diversi cuccioli; ora è
conservata in un museo a
Edimburgo.
CLONAZIONE “TERAPEUTICA”

• Molti si oppongono
• Problema di ordine scientifico
• Leggi statali ed internazionali
• 1997 Parlamento europeo si è espresso
contrario alla clonazione umana
• 2001 Conferenza Generale dell’UNESCO
ha emanato la Dichiarazione di Bioetica
e Diritti Umani
 MICROARRAY
• Oggi è possibile analizzare l’espressione di tutti i geni
di una cellula contemporaneamente grazie ai
microarray o biochip.

• Si tratta di piccole lastre di vetro o plastica delle

dimensioni di un chip di computer, su cui sono
immobilizzate migliaia di sonde molecolari ognuna
corrispondente ad una singola sequenza genica,
all’interno di micropozzetti da 50 µm.

• Oggi sono disponibili set di microarray che coprono

tutta la porzione codificante del genoma umano (90
milioni di sonde).
Due biochip, uno per l’analisi
del genoma umano e uno per
quella del genoma del topo.
Immagine: Schutz via
Wikimedia Commons
• Una applicazione dei microarray è l’analisi dell’espressione
differenziale di geni in due popolazioni cellulari.

1. L’mRNA è estratto da cellule di controllo (ad es. cellule di

un individuo sano) e dal campione sperimentale (es.
cellule tumorali).

2. L’mRNA viene convertito in cDNA e marcato con sonde

fluorescenti di diverso colore per i controlli
(ad es. verde) e i campioni (ad es. rosso).

3. I cDNA vengono ibridati al microarray. L’illuminazione al

laser rivelerà segnali rossi o verdi in corrispondenza dei
geni espressi solo in ciascuna delle due popolazioni, e
gialle (rosso+verde) per quelli espressi in entrambe.
LAVORO DI GRUPPO

V D
 GRUPPI DI LAVORO
• GRUPPO 1: Angelelli, Baliani, Bannetta;
Bernardini, Camplone

• GRUPPO 2: Caporuscio, Ciavatta, Cresca, Gay,

Hulay, Maccari

• GRUPPO 3: Meloni, Mozzicarelli, Nardi,

Niminet, Nunzi, Orazi

• GRUPPO 4: Procaci, Proietti, Rosato, Scipione,

Sena, Tomei
 ARGOMENTI
1)BIOTECNOLOGIE MEDICHE

2)BIOTECNOLOGIE AGRARIE

3)BIOTECNOLOGIE AMBIENTALI

4)BIOCOMBUSTIBILI E
BIOMATERIALI