GATEWAY SYSTEM & BiFC: Usos e Aplicações

2
Estudo da localização e interação
de proteínas com a célula
hospedeira

3
 Tecnologia Gateway

Fago λ

Recombinação
do Fago λ em E.
E. coli coli

4
5
BP CLONASE

6
Bp Clonase

Bp Clonase

7
Vetor de entrada

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 Representação esquemática da reação de
recombinação BP
Reação BP Clonase
attB attB attP attP attB attB
Gene Gene Gene

Produto PCR pDONR221 entry clone

Bp clonase

Meio LB liquido
37˚C /2h

Sequenciamento PCR Extração do DNA LB liquido a 37 ˚C Meio LB sólido com

plasmidial overnight Kanamicina
Incubadas 12 a 16h
a 37 ˚C
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LR CLONASE
10
LR Clonase

LR Clonase

11
Representação esquemática da reação de
recombinação LR

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VETORES PARA EXPRESSÃO DE
GENES

13
Vetor de expressão

14
Vetor de expressão

15
16
17
 Agrotransformação (“congelamento e descongelamento”)

5 µL plasmídeo recombinante LB solido contendo estreptomicina

(100 µg/ml), espectromicina (100
(derivado da reação LR clonase) + µg/ml) e rifampicina (100 µg/ml).
100 µL de suspensão de A.
tumefaciens estirpe LBA4404 em
10 mM de CaCl2

1 mL de
meio LB
liquido

5 minutos/37°C

5 segundos 2 horas/28°C

(GOODIN et, al., 2007) 18

Agroinfiltração

(GOODIN et, al., 2007)

19
Planta modelo (CHRISTIE AND CRAWFORD, 1978);

Suscetível a uma ampla gama de agentes patôgenicos;

Capacidade de se expressar genes estrangeiros;

Agroinfiltração funciona, exepcionalmente;

Pode ser geneticamente transformada e regenerada;

Contribui para a aquisição de micrografias de alta qualidade;

É a planta mais utilizada em experimentos de

complementação de fluorescência biomolecular (BiFC). 20
(GOODIN et al., 2008)
 BiFC (“Bimolecular fluorescence
complementation”)
Consiste na fusão de duas proteínas candidatas à interação a dois
fragmentos de uma proteína fluorescente, sendo uma delas ao N-terminal e
a outra ao C-terminal.

21
(CITOVSKY et al., 2008)
BiFC (“Bimolecular fluorescence complementation”)

Reação BP Clonase Reação LR Clonase

pSITE-BiFC-nYFP

pSITE-BiFC-cYFP

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 Proteínas Fluorescentes Usadas em Ensaios de BiFC

23
(KODAMA et al., 2012)
USOS E APLICAÇÕES
25
26
Resistência da Soja ao nematoide do cisto
Heterodera glycines

68%

76%
27
Resistência da Soja ao nematoide da galha
Meloidogyne incognita

77%

72%
28
29
(N) (n)(c)

(P) (n)

(3) (pc)

(M) (n)(c)

(G) (en)(mp)
30
(np)

(n)

(pn)

(pn)

(n)

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 Mapas de localização e interação entre as
proteínas e a célula hospedeira

• PILMs: protein interaction and localization maps

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 Considerações finais
 Uma das principais vantagens da tecnologia Gateway é que,
uma vez que o gene de interesse é clonado no vetor de
entrada, o gene pode ser facilmente subclonado em uma
ampla gama de vetores de expressão.

 BIFC é uma técnica altamente sensível que permite a

visualização direta dos complexos proteicos em células vivas.

 O nivel de expressão das proteínas, o uso inadequado de

controles, as quantificações da reconstrução do sinal e a
interpretação dos resultados poderiam ser alguns limitantes
da técnica BiFC.
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 Considerações finais
 Nos últimos anos, estas duas técnicas tem sido
bastante utilizadas numa ampla gama de estudos
de genômica funcional, visando elucidar e
entender os processos dinâmicos que ocorrem
entre microrganismos fitopatogênicos e plantas
hospedeiras de importância econômica.

 As duas técnicas tornam-se alternativas

importantes na prospecção de novos genes
envolvidos na supressão do sistema imune da
planta, fornecendo informações essenciais para a
criação de plantas transgênicas resistentes, que
podem ser usadas na agricultura. 34
 35
Saul R.I.P
manupinzon85@hotmail.com

36
GATEWAY Recombination Cloning Vs Traditional
Restriction Enzyme Cloning

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 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Fusionar os genes virais a proteínas fluorescentes e expressá-
los via Agrobacterium tumefaciens com a finalidade de
verificar a localização das proteínas virais;

• Expressar os genes em plantas que reagem com infecção

sistêmica e lesões locais, visando conhecer detalhes da
interação patógeno-hospedeira nos diferentes processos
infecciosos;

• Elaborar o mapa de localização sub-celular e de interação

entre as proteínas virais, como os já existentes para outros
potyvirus, por meio da técnica de complementação
fluorescente bimolecular (BiFC – “bimolecular fluorescence
complementation”);
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 METODOLOGIA
• Condução dos experimentos
Lab. Virologia Molecular-Microscopia DPF/UFLA

• Isolado viral e obtenção das plantas

Plantas de soja cv.
Santa Rosa
Solução tampão
Fosfato 0,01M Ph7

Plantas transgênicas marcadas com RFP

fusionadas à histona 2b e ao39
ER
 METODOLOGIA
• Extração do RNA e amplificação dos genes RT-PCR
Qiagen Rneasy Plant minikit
Extração do RNA
6K1, 6K2,
Taq DNA polimerase primers
P1, P3,
PCR PIPO, CP,
CI, VPg,
HcPro, Nib
e Nia
RT-PCR
transcriptase reverse
Superscript III (Invitrogen) 35 ciclos
T˚ anelamento especificas

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CONTRIBUIÇÕES DO PROJETO E PERSPECTIVAS

• Através da localização subcelular e interação

das proteínas do SoYSV espera-se conhecer
aspectos importantes no processo de infecção
e translocação do vírus, visando identificar
detalhes da interação patógeno-hospedeira.

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CONTRIBUIÇÕES DO PROJETO E PERSPECTIVAS

• A elaboração de mapas de localização e

interação permitirá facilitar o entendimento
dos diferentes mecanismos moleculares que
envolvem os processos de infecção e
transmissão viral.

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Reacção LR Clonase

LR clonase

Choque térmico
attB attB GFP
Gene
Clone de
expressão

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44