Clase 9 2019, Biotecnología

Facultad Regional de Rosario
Cátedra de
Biotecnología
Prof. Adj. Ord.:
Dr. Ing. Germán Campetelli
J. T. P.: Ing. Marta Ortega
Aux. 1º Ing. Pablo Garibaldi
1 Ingeniería Química
2 2-ene.-20
TEMA 6: Bioingeniería de Proceso

BIOREFINERIAS
Cátedra de Biotecnología
3 2-ene.-20

BIOREFINERIAS
 La producción petroquímica actual se puede reducir un 20 %

en diez años gracias al uso de procesos biotecnológicos.
 La utilización de productos de base biológica pueden reducir
entre un 50 y un 80 % el uso de productos de base fósil, con
emisiones de CO2 50% menores.
 Los procesos biotecnológicos pueden generan ahorros
energéticos de hasta el 30 %.
Referencia: “Industrial Biotechnology and Climate Change”, OECD 2011.
4 2-ene.-20
Referencia: Industrial Biotechnology, Delft University of Technology, Países Bajos (2015).

5 2-ene.-20

Renovables
Referencia: Industrial Biotechnology, Delft University of Technology, Países Bajos (2015).

6 2-ene.-20

BIOREFINERIAS
7 2-ene.-20

BIOREFINERIAS
8 2-ene.-20

Efectores Internos:
genética
Efectores Químicos:
nutrientes Célula Expresión Producto
Efectores Físicos:
temperatura, viscosidad,
agitación, etc.
9 2-ene.-20

 Procesos industriales en donde intervienen células o
biomoléculas (enzimas).
 Objetivos:
 Obtención de más m.o.: levaduras, proteína unicelular, etc.
 Obtención de metabolitos: antibióticos, alcohol, enzimas, etc.
 Limpieza de un solvente: tratamiento de efluentes,
transformación de contaminantes, etc.
 Conversión de una sustancia en otra/s: producción de
azucares con enzimas, blanqueo enzimático de la pasta de
papel, etc.
10 2-ene.-20

 FERMENTACION: IMPORTANTE!!!
 Bioquímica: proceso catabólico de oxidación incompleta, que no
requiere oxígeno, y el producto final es un compuesto orgánico.
 Bioingeniería: incluye a todos los procesos, incluso a los aeróbicos
y a los enzimáticos.
Referencia: “Chemical Reaction

Engineering”, Octave Levenspiel,
3rd Ed.
11 2-ene.-20

 Producción de metabolitos:
 Metabolitos Primarios: generalmente comunes a todos los m.o.

 Moléculas sencillas que participan de las rutas metabólicas esenciales.
 Poca “actividad biológica”, baratos y sencillos de producir
(commodities).
 1. Componentes esenciales de las células/m.o.: proteínas, ácidos nucleicos,
polisacáridos y poliésteres, ácidos grasos, esteroles.
 2. Derivados del metabolismo intermedio: azúcares, ácidos orgánicos, alcoholes,
aminoácidos, vitaminas, nucleótidos…
12 2-ene.-20

 Producción de metabolitos:
 Metabolitos Secundarios: dependen fuertemente de la especie.

 Moléculas complejas que participan de rutas metabólicas no-esenciales,
pero que confieren capacidades de supervivencia en situaciones de
estrés.
 Mucha “actividad biológica”, caros y difíciles de producir (alto valor
agregado).
 Funcionan en los organismos que los producen como:
 1. Armas contra otros m.o.: antibióticos, toxinas, inhibidores enzimáticos,
pesticidas…
 2. Factores de crecimiento: hormonas.
 3. Ionóforos: molécula soluble en lípidos utilizada para transportar iones a través de
la bicapa lipídica de la membrana celular.
13 2-ene.-20

 El interés en la microbiología industrial se debe al pequeño
tamaño de la célula y su alta relación superficie/volumen.
 Esto facilita el transporte de nutrientes al interior de la célula y

permite una alta tasa metabólica.
 Selección del m.o. (screening):

 Producir en corto tiempo la sustancia de interés.
 Estar disponible en cultivo puro.
 Crecer en un medio de cultivo económico.
 Ser genéticamente estable.
 Crecer rápidamente y en cultivos a gran escala.
 No ser patógeno para humanos, animales ni plantas.
 De fácil conservación por largos períodos de tiempo.
 Ser fácil de separar las células del medio de cultivo.
14 2-ene.-20
Los nuevos métodos de “screening” incorporan

técnicas de Ingeniería Genética para crear
diversidad…
Lo que se buscan son genes, los cuales se insertan en m.o. bien
estudiados (Escherichia Coli, Saccharomyces Cerevisiae por ejemplo).
15 2-ene.-20
UPSTREAM DOWNSTREAM
Materias O. U. Físicas de O. U. Químicas O. U. Físicas de

Productos
Primas acondicionamiento (Reactores) separación
Recirculación
Tratamiento
de Efluentes
16 2-ene.-20
17 2-ene.-20
UPSTREAM FERMENTACION DOWNSTREAM
Ingeniería
Genética / Metabólica
Esterilización Operaciones
Unitarias:
Adecuación de MP
Operaciones unitarias: Diseño del Reactor
molienda, filtración, • Filtración
• Aireación
evaporación, etc. • Agitación • Ultrafiltración
• Sistema de control • Osmosis inversa
automático • Extracción L – L
Transformaciones • Escalado (scale-up) • Extracción S – L
enzimáticas • Ruptura celular
• Cristalización
Modo de operación • Destilación
• Batch • Cromatografía
• Batch alimentado •
Preparación medio • Continuo •
de cultivo •
•
18 2-ene.-20
Preparación de medios de cultivo:
 Medios sintéticos o químicamente definidos.

 Medios complejos que aportan las sustancias
fundamentales pero son químicamente indefinidos y de
composición variable.
 Los componentes de los medios de cultivo son los

“efectores externos” de naturaleza química que deben
cumplir con los requerimientos del crecimiento y de
formación de productos y suministrar energía para el
mantenimiento celular.
 MACRONUTRIENTES [g/l]: C, N, S, P, K y Mg.
 MICRONUTRIENTES o trazas [mg o ug/l]: Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y
Co.
 FACTORES DE CRECIMIENTO: vitaminas, aminoácidos y lípidos
esenciales, etc.
19 2-ene.-20
Químicamente definido (estequiométrico)

Medio mínimo para el crecimiento de Bacillus megaterium. Un ejemplo de medio
químicamente definido para el crecimiento de bacterias heterotróficas.
Componente Cantidad Función del componente
Sucrosa 10.0 g C y fuente de energía
K2HPO4 2.5 g Buffer pH; fuente de P y K
KH2PO4 2.5 g Buffer pH; fuente de P y K
(NH4)2HPO4 1.0 g Buffer pH; fuente de N y P
++
MgSO4 7H2O 0.20 g Fuente de S y Mg
++
FeSO4 7H2O 0.01 g Fuente de Fe
++
MnSO4 H2O 0.007 g Fuente de Mn
Agua 985 ml
pH 7.0
20 2-ene.-20
Medio selectivo enriquecido para el crecimiento de halofílicas extremas.

Componente Cantidad Función del componente
Ácidos Casamino 7.5 g Fuente de aminoácidos, N, S y P
Extracto de levadura 10.0 g Fuente de factores de crecimiento
Citrato trisódico 3.0 g C y fuente de energía
+
KCl 2.0 g Fuente de K
++
MgSO4 7 H2O 20.0 g Fuente S y Mg
++
FeCl2 0.023 g Fuente Fe
+
Fuente de Na para halofílicas e inhibidor
NaCl 250 g
para no halofílicas
Agua 1000 ml
pH 7.4
21 2-ene.-20

Fuentes de carbono:
 Melaza de caña o remolacha azucarera.
 Almidón de cereales o papa.
 Suero de la leche.
 Glicerina (subproducto de la producción de biodiesel).
 Material celulósico de plantas.
 Desechos de alimentos.
 Aceites vegetales.
 Dióxido de carbono (autótrofos). Cátedra de Biotecnología

22 2-ene.-20
23 2-ene.-20

FERMENTADORES
 Fermentador discontinuo o batch:
 Es un sistema cerrado.
 Al inicio de la operación se añade el medio de
cultivo esterilizado y se inocula el m.o.
 Durante la fermentación solo se añade O2,
antiespumante y ácidos o bases para regular el pH.
 La composición del medio de cultivo, biomasa y
metabolitos cambia en el tiempo:
24 2-ene.-20

FERMENTADORES El más utilizado
en la industria!
 Fermentador discontinuo alimentado (Fed-Batch):
 Es útil cuando el crecimiento celular y/o la formación de

productos son sensibles a la concentración de sustrato.
 Se consiguen altas concentraciones de células.
 Los sustratos se añaden escalonadamente a medida
que progresa la fermentación.
Bomba
Peristáltica
25 2-ene.-20

FERMENTADORES
 Fermentador continuo:
 Es un sistema abierto.
 El medio de cultivo estéril se añade continuamente al
biorreactor y una cantidad equivalente del fermento
con los m.o. se retira simultáneamente.
 Los m.o. pueden separarse de la corriente de salida y
recircularse al fermentador.
 Hay dos tipos:
 Quimiostato: el flujo de entrada de un nutriente se mantiene
constante.
 Turbidostato: la concentración celular se mantiene constante.
26 2-ene.-20

FERMENTADORES
 Fermentador continuo: Quimiostato
27 2-ene.-20

FERMENTADORES
 Fermentador continuo: Turbidostato
28 2-ene.-20

MEDICION DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
 Recuento de colonias (UFC).

 Peso Seco celular:
 1 ml de cultivo en tubo Eppendorf, centrifugación,
descartar sobrenadante y secar en estufa hasta peso
constante.
 1 ml de cultivo se filtra a través de membranas hidrofílicas
con tamaño de poro de 0.2 μm, se lava con solución salina
isotónica y se seca hasta peso constante.
 Absorción: por espectrofotometría, con longitudes de
onda de 600 nm (DO: densidad óptica).
NOTA: la absorción y el peso seco se correlacionan.
29 2-ene.-20

 Recuento de colonias (UFC).

 Peso Seco celular:
 1 ml de cultivo en tubo Eppendorf, centrifugación,
descartar sobrenadante y secar en estufa hasta peso
constante.
 1 ml de cultivo se filtra a través de membranas hidrofílicas
con tamaño de poro de 0.2 μm, se lava con solución salina
isotónica y se seca hasta peso constante.
 Absorción: por espectrofotometría, con longitudes de
onda de 600 nm (DO: densidad óptica).
NOTA: la absorción y el peso seco se correlacionan.
30 2-ene.-20

 Peso húmedo: incluye el H2O intra y extracelular.

 Volumen de células empacadas (VCE): por
centrifugación en tubos graduados.
 Numero de células: se cuentan con microscopio
usando portaobjetos graduados.
 Masa de un componente celular: N2, ADN, ARN, etc.
 Mediciones físicas:
 Generación de calor: útil en gran escala.
 Rapidez de captación de O2.
31 2-ene.-20

FERMENTADORES
 Es el corazón del proceso y se debe optimizar para

evitar posteriores etapas de separación y purificación.
 Factores: Temperatura
 Factores: pH
El pH óptimo suele ser distinto para el crecimiento que para la
formación del producto.
 Factores: potencial redox
Esta relacionado a la concentración de O2 disuelto (OD), al pH
y a la presencia de iones.
Se puede reducir bajando el OD (burbujeando N2) o
agregando agentes reductores.
32 2-ene.-20

FERMENTADORES
 Factores: concentración de CO2 disuelto

Puede ser toxico para algunas células y necesario para otras.
La solubilidad del CO2 en al agua pura a 25°C es de 1,45 g/L.
 Factores: fuerza iónica
Afecta el transporte de ciertos nutrientes desde y hacia el
interior de la célula.
 Factores: concentración de O2 disuelto (OD)
 Debido a la baja solubilidad del O2 en H2O, suele ser un limitante
de la velocidad de crecimiento, especialmente en cultivos de
gran densidad de células.
 Ejemplo: un cultivo de levaduras de 109 células / ml respirando,
agotan el OD del medio 12 veces / min.
 La solubilidad del O2 en agua pura a 25 °C es de 8,11 mg/L.
33 2-ene.-20

FERMENTADORES: DEMANDA DE OXIGENO
 Depende principalmente del m.o., de la fase de

crecimiento en la que se encuentre y del medio de
cultivo. A partir de cierta concentración (Ccrit) también
depende del OD:
qo : velocidad de consumo especifico de O2, [mol O2/g célula/s] Cátedra de Biotecnología

Qo = qoX : velocidad de consumo de O2 por volumen de cultivo, [mol/l/s]
X: concentración de células, [g célula/l]
34 2-ene.-20

TRANSFERENCIA DE OXIGENO
Referencia: “Principios de Ingeniería Cátedra de Biotecnología

de los Bioprocesos”, Doran, P.M.
35 2-ene.-20

1. Transferencia dentro de la burbuja hacia la interfase G – L.

2. Movimiento a través de la interfase G – L.
3. Difusión a través de la película líquida estanca en torno a la
Dominante
burbuja.
4. Transporte en el seno del líquido.
5. Difusión a través de la película líquida estanca en torno al
floculo celular.
Dominante
solo si el 6. Entrada al floculo celular.
floculo es
grande
7. Difusión a través del floculo celular.
8. Movimiento a través de la membrana celular.
9. Transporte en el citoplasma hasta llegar al sitio de la
reacción de oxidación dentro de la célula.
36 2-ene.-20

(solo valida si domina el punto 3)

NA = kLa(CAL* - CAL)
Donde:
NA: velocidad de transferencia de O2 por unidad de volumen, [mol O2/m3/s]

kL: coeficiente de transferencia de masa de la fase líquida, [m/s]
a: área de la interfase G-L por unidad de volumen, [m2/m3]
CAL: concentración de O2 en el medio de cultivo, [mol/m3]
CAL*: conc. de O2 en el medio en equilibrio con la fase G, [mol/m3]
Nota: CAL* es la solubilidad del O2 en el medio (conc. máxima

posible).
37 2-ene.-20

TRANSFERENCIA DE OXIGENO: Ley de Henry
CAL* = po / H
Donde:
po: presión parcial de O2 en la fase gaseosa

H: constante de Henry (depende del gas, del líquido y de T)
 Si se insufla aire se consigue una concentración de O2 de

8 mg O2 / l H2O.
 Si se insufla O2 puro se consigue 43 mg O2 / l H2O.
38 2-ene.-20

En Estado Estacionario:
NA = Qo
kLa(CAL* - CAL) = qoX
kLa es un valor de diseño de los fermentadores, se utiliza

para saber la capacidad de un equipo para transferir O2 y
también como criterio de escalado (kLa = cte.).
qoX kLaCAL∗
(kLa)crit = Xmax =
(CAL∗ − Ccrit) qo
39 2-ene.-20

Parámetros que influyen:
 Microorganismo.
 Diseño del fermentador: burbujeadores, agitadores, bafles,
geometría.
 Medio de cultivo: viscosidad, solubilidad del O2, presencia de
tensioactivos (antiespumantes).
 Parámetros del proceso: velocidad de agitación (RPM),
caudal de aireación (VVM), presión parcial de O2 (pO2).
VVM: volumen de aire por volumen de medio por minuto.
40 2-ene.-20

AIREACION / AGITACION
 Ambos sirven para regular el kLa.

 Sirven para mantener las células en suspensión y
aumentar el área de contacto.
 Sirven para homogeneizar el medio de cultivo.
 Favorecen la transferencia de calor en el
fermentador.
 La agitación ayuda a dispersar las burbujas de
gas para mejorar la transferencia.
 Eliminan gases que pueden ser tóxicos (CO2).
41 2-ene.-20

AIREACION / AGITACION
 Como aumentar el kLa:

 Aumentando la agitación (>RPM).
 Aumentando el flujo de aire (>VVM).
 Aumentando la presión parcial de O2.
 Diseño del reactor: paletas, baffles…
 Reología del medio del cultivo (< viscosidad).
 Usar micro-burbujeadores.
42 2-ene.-20

DETERMINACION DE kLa
Método Dinámico
Se basa en un balance de masa del O2 en estado no
estacionario:
𝑑𝐶𝐴𝐿
= VTO - VCO
𝑑𝑡
VTO: velocidad de transferencia de O2
VCO: velocidad de consumo de O2
𝑑𝐶𝐴𝐿
= NA - Qo
𝑑𝑡
𝑑𝐶𝐴𝐿
= kLa(CAL* - CAL) - qoX
𝑑𝑡
43 2-ene.-20

Método Dinámico
Se basa en un balance de masa del O2 en estado no
estacionario:
𝒅𝑪𝑨𝑳
(1) = kLa(CAL* - CAL) - qoX
𝒅𝒕
𝒅𝑪𝑨𝑳
Cuando 𝑪𝑨𝑳 = 𝑪
෩𝑨𝑳 =0
𝒅𝒕
qoX = kLa(CAL* - 𝑪
෩𝑨𝑳 )
Reemplazamos en (1):
𝒅𝑪𝑨𝑳
= kLa(𝑪
෩𝑨𝑳 - CAL)
𝒅𝒕
44 2-ene.-20

Método Dinámico
𝒅𝑪𝑨𝑳
= kLa(𝑪
෩𝑨𝑳 - CAL)
𝒅𝒕
Integramos:
෩𝐴𝐿 − 𝐶𝐴𝐿1
𝑪
ln ෩
𝑪𝐴𝐿 − 𝐶𝐴𝐿2
𝒌𝑳 𝒂 =
𝒕𝟐 − 𝒕𝟏
45 2-ene.-20

FERMENTADORES: tanque agitado
• Mezclado y dispersión de gas se

consigue con agitación mecánica.
• Se llenan en un 70-80 % debido a la
formación de espuma.
• Aptos para fluidos viscosos.
• A altas revoluciones los agitadores
pueden generar esfuerzos de corte
en biomoleculas.
46 2-ene.-20

FERMENTADORES: columna de burbujeo
• Mezclado y dispersión de gas se

consigue con el burbujeo de gas.
• Requieren menos energía que los
tanques agitados.
• Son altos para aumentar el
tiempo de residencia de las
burbujas de gas.
47 2-ene.-20

FERMENTADORES: air-lift (aire ascendente)
• Tienen una
corriente de
recirculación
interna que
favorece el
mezclado.
• La recirculación
se da por
diferencia de
densidad.
• Son de grandes
volúmenes.
48 2-ene.-20

FERMENTADORES: lecho empacado
• Se usan con
biocatalizadores
particulados o
inmovilizados.
• El desgaste de las
partículas es
mínimo.
• Inapropiado para
procesos donde se
producen grandes
cantidades de
CO2.
49 2-ene.-20

• Inmovilización: tiene aplicación si los productos son

extracelulares.
• Existen reactores con microorganismos inmovilizados y
también con enzimas inmovilizadas.
• Inmovilización:
• Activa: captura o unión de células (o enzimas) por
métodos físicos o químicos.
• Pasiva: formación de biofilms, crecimiento de múltiples
capas de células sobre un soporte sólido.
50 2-ene.-20

• El soporte puede ser inerte o biológicamente activo.

• El espesor del biofilm afecta la performance: muy fino da
baja velocidad de crecimiento y muy grueso tiene
problemas difusionales.
51 2-ene.-20

FERMENTADORES: lecho fluidizado
• El catalizador debe tener un

tamaño y densidad
apropiados.
• Se evita la formación de
canales y de zonas muertas.
• Apropiado para
microorganismos floculantes.
52 2-ene.-20

FERMENTADORES: lecho de goteo
• Lecho percolador.
• Es una variación del lecho
empacado.
• El liquido es suministrado en
forma de spray y desciende
formando “riachuelos”.
• Se utilizan en procesos
aeróbicos y con formación de
gases.
53 2-ene.-20

FERMENTADORES: fotobiorreactores
• Se usan para el cultivo de

microalgas.
• Son transparentes ya que el
principal factor que afecta a
su diseño es la penetración de
la luz (las algas deben realizar
la fotosíntesis).
• Pueden tener configuraciones
como las ya vistas: lecho
fluidizado, de goteo, air-lift, etc.
54 2-ene.-20
55 2-ene.-20
56 2-ene.-20
57 2-ene.-20
58 2-ene.-20
59 2-ene.-20

Clase 9 2019, Biotecnología

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TEMA 6: Bioingeniería de Proceso

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 La producción petroquímica actual se puede reducir un 20 %

Referencia: “Industrial Biotechnology and Climate Change”, OECD 2011.

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Referencia: Industrial Biotechnology, Delft University of Technology, Países Bajos (2015).

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 Metabolitos Primarios: generalmente comunes a todos los m.o.

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 Esto facilita el transporte de nutrientes al interior de la célula y

 Selección del m.o. (screening):

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Materias O. U. Físicas de O. U. Químicas O. U. Físicas de

TEMA 6: Bioingeniería de Proceso

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Preparación de medios de cultivo:

 Medios sintéticos o químicamente definidos.

 Los componentes de los medios de cultivo son los

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Preparación de medios de cultivo:

Químicamente definido (estequiométrico)

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Medio selectivo enriquecido para el crecimiento de halofílicas extremas.

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 Es útil cuando el crecimiento celular y/o la formación de

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 Recuento de colonias (UFC).

NOTA: la absorción y el peso seco se correlacionan.

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 Recuento de colonias (UFC).

NOTA: la absorción y el peso seco se correlacionan.

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 Peso húmedo: incluye el H2O intra y extracelular.