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Attività elettrica dei

neuroni

Neuroni piramidali del SNC che stanno crescendo su una matrice di glia/fibroblasti
Nel potenziale d’azione si distinguono due fasi:
-fase di DEPOLARIZZAZIONE
-fase di RIPOLARIZZAZIONE

tempo
Basi ioniche del potenziale d’azione

• conduttanze e correnti di Na voltaggio-dipendenti


• conduttanze e correnti di K voltaggio-dipendenti
Qual è il ruolo dei canali del Na+ nella genesi del potenziale d’azione?

1. Osservazione di Hodgkin e Huxley (1939):


– al picco di un potenziale d’azione il potenziale di membrana diventa
transitoriamente positivo all’interno – overshoot.

2. Ipotesi: è coinvolto il Na
– l’entrata di Na attraverso la membrana continuerà fino al raggiungimento
del potenziale di equilibrio del Na (ENa).
ENa = 58 log ([Na]o / [Na]i) = 58 log (460/50) = 59 mV
50% [Na]o -> ENa = 38 mV
33% [Na]o -> ENa = 28 nV

3. Esperimento di Hodgkin e Katz (1949):


riducendo [Na]o  riduzione dell’overshoot

Conclusione:
Il potenziale d’azione è il risultato di un
grande e transitorio aumento nella
permeabilità al Na della membrana.

PK : PNa : PCl
Al potenziale di riposo 1.0: 0.04: 0.45
Al picco del PA 1.0 : 20 : 0.45
Che dire della fase di caduta del potenziale d’azione?
- I canali del Na semplicemente si chiudono (inattivazione)
Ma se la causa fosse solo questa, la ripolarizzazione sarebbe più lenta di quanto
osservato sperimentalmente

- Si verifica un successivo grosso aumento della permeabilità della membrana al K


dovuto all’apertura di canali del K voltaggio-dipendenti.

Il potenziale di membrana ritorna verso EK

Il potenziale di membrana iperpolarizza (diventa più


negativo del potenziale di riposo) per un certo tempo
Per spiegare l’ampiezza e l’andamento temporale del potenziale d’azione

Ipotesi: Le conduttanze del Na e K sono voltaggio-dipendenti


- La probabilità che i canali si aprano aumenta con la depolarizzazione.

L’effetto della conduttanza al Na Aumento


- rigenerativo. di gNa

Il processo
Depolarizz. Corrente di
-si autoalimenta Na entrante
-feedback positivo

La depolarizzazione aumenta la Aumento


conduttanza al K con un certo ritardo. di gK

-autolimitante
-feedback negativo Corrente di
K uscente
Depolarizz.

Ripolarizz.
Ipotesi di Hodgkin e Katz:
La depolarizzazione della cellula al di sopra del valore di soglia causa un breve aumento
della permeabilità della membrana agli ioni Na.

In che maniera la permeabilità di membrana (conduttanza) agli ioni Na varia con il potenziale di membrana?

gNa = INa / (Vm – ENa)

Esperimento: Occorrerebbe misurare l’ampiezza della


corrente di Na+ (INa) che fluisce attraverso la membrana
a diversi livelli del potenziale di membrana (Vm) depolarizzazione

INa entra. Canali Na


C’è un problema: La corrente fluisce aprono
attraverso la membrana  il potenziale
di membrana cambia  la conduttanza
della membrana si modifica sia al
variare del potenziale di membrana che
nel tempo
Per risolvere questo problema,
Cioè, esiste forte interdipendenza del K. Cole sviluppò la tecnica del
PM e del gating dei canali del Na (e del voltage-clamp.
K)  sia il PM che la conduttanza dei
canali cambiano costantemente.
Alcuni tipi di canali Ionici sono sempre aperti, altri no!

extracell.

intracell.

Sempre Voltaggio-dipendenti:
aperti rispondono a
variazioni di Vm

Il loro comportamento è Il loro comportamento non


è ohmico: la relazione I/V
ohmico: la relazione I/V è
lineare  g=costante non è lineare perché g
non è costante [g=f(Vm)]
Modello del gating secondo H&H

Il modello di H&H della gate assume una reazione cinetica del 1o


ordine tra gli stati aperto e chiuso della particella di gating
a
C O
b

Quindi, la probabilità della particella di trovarsi nello stato


aperto può essere descritta da:
a
(1-Po) Po
b

Trattandosi di una cinetica del 1o ordine, sarà:


dPo
 a (1  Po )  bPo
dt
dPo
Allo stato stazionario (equilibrio) sarà:  a (1  Po )  bPo  0
dt
quindi, a
P 
o
ab

Risolvendo l’equazione differenziale del 1o ordine e applicando


la condizione al contorno Po0  Po(t  0), si ottiene:
 
Po( t )  Po0  ( Po  Po0 ) 1  e ( a  b )t 
1/(ab)=t rappresenta la costante di tempo dell’attivazione ed è
un indice della velocità di attivazione della particella di gating.
1.0
Po(t)

Prob. Di Attivaz.
Se p particelle di gating indipendenti 0.8

0.6
sono coinvolte nel gating del canale, [Po(t)]p
0.4
allora il canale seguirà il seguente
andamento temporale: Pochann (t )  Po(t )p
0.2

0.0

0 2 4 6 8
Tempo
La tecnica del voltage-clamp consiste nel bloccare il potenziale di membrana
ad un valore costante nel tempo e nel registrare le correnti ioniche
transmembranarie generate a tale potenziale di membrana

20 Potenziale di membrana
finale (Vm) costante

(mV)
(potenziale di comando)
Potenziale di riposo (Vr) -70
0 10 20 30 40
Tempo (ms)
60
Corrente transmembranaria
40 generata dal passaggio di
Corrente ionica (nA)

Vm da –70 mV a +20 mV
20

-20

-40

-60
0 10 20 30 40
Tempo (ms)

Vantaggi del voltage-clamp:


In genere, nel caso di canali voltaggio-dipendenti, gm = f(V,t) ma,
1. Vm è bloccato ad un valore costante  gm = f(t) soltanto e può essere dedotto dall’andamento
della corrente ionica Ii
2. E’ possibile separare Ii da Ic. Infatti cm è caricata istantaneamente
Voltaggio (mV) Separazione farmacologica delle correnti IK e INa

20

-70
0 10 20 30 40
Tempo (ms)

+ TTX (IK)
60
INa+IK
40
Corrente ionica (nA)

20

-20 + TEA (INa)

-40

-60
0 10 20 30 40
Tempo (ms)
Voltaggio-dipendenza dei canali Kv
60
140
50
40 120
30
20 100
Voltaggio (mV)

10

I(K ) max (nA)


0 80
-10
-20 60
-30

+
40
IK=gK• (V-EK)
20

-70 0

0 10 20 30 40 -20
-30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60
Tempo (ms)
Voltaggio (mV)

140
1.0
120

100 0.8

Conduttanza (μS)
Corrente K + (nA)

80 0.6
60
0.4
40 gK = IK/(V-EK)
20 0.2
EK=-80 mV
0 0.0
-20
0 10 20 30 40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60

Tempo (ms) Voltaggio (mV)


Canali voltaggio-indipendenti
Il potenziale di riposo di una cellula è determinato dalla presenza
di due canali permeabili rispettivamente ai cationi A+ e B+
attraverso i quali passano le correnti ioniche IA e IB indicate in
tabella.
Dopo aver disegnato i rispettivi grafici I/V, determinare:
1) le conduttanze gA e gB;
2) se i due canali sono voltaggio-dipendenti o -indipendenti;
3) il potenziale di equilibrio dei due ioni A e B;
4) il potenziale di riposo Vr della cellula.
V(mV) IA (nA) V(mV) IB (nA)
-120 -1650 -20 -1320
-110 -1100 -10 -1100
-100 -550 0 -880
-90 0 10 -660
-80 550 20 -440
-70 1100 30 -220
-60 1650 40 0
-50 2200 50 220
-40 2750 60 440
-30 3300 70 660
V(mV) IA =gA (V-EA ) (nA) V(mV) IB=gB(V-EB) (nA) 4000

-120 -1650 -20 -1320


3000
-110 -1100 -10 -1100
-100 -550 0 -880 2000
-90 0 10 -660 EA EB
-80 550 20 -440 1000
-70 1100 30 -220
-60 1650 40 0 0
-50 2200 50 220 -150 -100 -50 0 50 100
-40 2750 60 440 -1000
-30 3300 70 660
-2000

EA=-90mV g1A=-1650/[-120-(-90)]= 55 mS

EB=+40mV g1B=-1320/[-20-(+40)]= 22 mS

Vr=(E AgA+EBgB)/(g A+gB)= -52.9 mV


Quesito del giorno
Un ricercatore, in seguito ad esperimenti condotti in voltage-
clamp ha ricavato che la corrente di K+ (IK) dipende dal potenziale
di membrana (V) secondo la seguente relazione:
 1  (pA)
IK  4.6  (V  85)   1  (V 10) / 9 
 1 e 

1) Calcolare i valori di IK nell’intervallo di potenziali tra –80 e


+80 mV ad intervalli di 10 mV e metterli in grafico in funzione di
V;
2) Dai valori di IK ricavati, e sapendo che EK= -85 mV, calcolare i
valori corrispondenti di gK e metterli in grafico in funzione di V;
3) A quale valore di V sara’ aperta la meta’ dei canali?
IK = 4.6·[1-1/(1+EXP((V+10/9))]·(V+85)
(pA)
EK = -85 mV
800

pA
Vm IK Vm -EK gK
600
-80 0.0 5 0.002
-70 0.1 15 0.006 400
-60 0.4 25 0.018
-50 1.9 35 0.053 200
-40 7.1 45 0.158
-30 24.7 55 0.450 0
-20 74.1 65 1.139 -100 -50 0 50 100

-10 172.5 75 2.300 mV


0 294.2 85 3.461
10 394.3 95 4.150
20 466.4 105 4.442

nS
30 522.9 115 4.547 5.0
40 572.8 125 4.582 4.0
50 620.2 135 4.594
60 666.7 145 4.598 3.0

70 712.9 155 4.599 2.0


80 759.0 165 4.600
1.0

0.0
-100 -50 0 50 100
mV
Voltaggio-dipendenza dei canali Na
1
60
0
40
30 -1
20
Voltaggio (mV)

I(Na) picco (nA)


10 -2
0
-3
-10
-20 -4
-30
-40 -5 INa=gNa• (V-ENa)
-50
-6
-70
-7
0 1 2 3 4 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 60
Tempo (ms)
Voltaggio (mV)
0
-1
I(Na) (nA)

-2
-3 0.14 gNa = INa/(V-
-4
0.12
ENa)
-5
ENa=+50 mV

Conduttanza (μS)
-6 0.10
-7
0 1 2 3 4 0.08
Tempo (ms)
0.06
0
I(Na) (nA)

-1 0.04
-2 0.02
-3
-4 0.00
-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40
-5
0 1 2 3 4 Voltaggio (mV)
Tempo (ms)
Separazione della fase di attivazione della corrente
di Na dall’inattivazione
La pronasi rimuove l’inattivazione
Voltaggio (mV)
-80 -60 -40 -20 0 20 40
40
30
0
20

Corrente di Na (nA)
Voltaggio (mV)

10
0 -200
-10
-20
-30 -400
-40
-50
-60
-70
-600
-80
-90
-800
0 10 20 30 40

tempo (ms)

0 2.5
1
-200
2.0

Conduttanza ( m S)
Corrente (nA)

Prob. canale aperto


-400
1.5
-600

-800 1.0 0.5

-1000
0.5
-1200

0 0
0 10 20 30 40

tempo (ms) -80 -60 -40 -20 0 20 40


Voltaggio (mV)
L’ampiezza della corrente di K aumenta con la depolarizzazione.
L’ampiezza della corrente di Na aumenta e poi diminuisce con la depolarizzazione.

Perchè?

Depolarizzazione: Depolarizzazione:

IK= gK (Vm–EK) INa= gNa (Vm–ENa)

La corrente attraverso il canale dipende da


1. Permeabilità del canale: conduttanza
le conduttanze del Na e K sono voltaggio-dipendenti
2. Driving force – dovuta al potenziale elettrico attraverso
la membrana e al gradiente di concentrazione degli ioni.
Come risalire dai valori di conduttanza allo stato stazionario
alla probabilità di trovare una singola gate del canale aperta

Grafico della conduttanza g(V) allo stato stazionario


Nel caso di un canale inattivante, esso è stato ottenuto
rimuovendo l’inattivazione
Gmax
2.5
1
g  (V )  Po
2.0
C onduttanza ( m S)

Prob. canale aperto


1.5

 g
P 
1.0 0.5

o
0.5
Gmax
0 0

-80 -60 -40 -20 0 20 40


Voltaggio (mV)

Ipotesi: l’attivazione del canale è regolata da x gates n uguali e indipendenti.


Allora, se n∞ è la probabilità di avere la singola gate n aperta allo stato stazionario, la probabilità Po di
trovare il canale aperto allo stato stazionario (in assenza di inattivazione) sarà:

Po  n
x
Probabilità composta: n·n·n…. (x volte)

Quindi, dai valori di Po si può risalire ai valori di n∞: n  x Po


Quesito del giorno
Un ricercatore, in seguito ad esperimenti condotti in voltage-
clamp e utilizzando la tossina di scorpione per bloccare
l’inattivazione, ha ricavato che la conduttanza del canale del
Na+ (gNa) dipende dal potenziale di membrana (V) secondo la
seguente relazione:
 1  (nS)
gNa  5.6   1  (V  30) / 6 
 1 e 
1) Calcolare i valori di gNa nell’intervallo di potenziali tra –
80 e +80 mV ad intervalli di 10 mV e metterli in grafico in
funzione di V; a quale valore di gNa sarà aperta la metà dei
canali?
2) Dai valori di gNa ricavati, e sapendo che ENa= +55 mV,
calcolare i valori corrispondenti di INa e metterli in grafico in
funzione di V.
gNa=5.6(1-1/[1+EXP((V+30)/6)]) (nS)
ENa=+55 mV

nS
6.0

5.0

4.0
Vm gNa (nS) Vm -ENa INa (pA)
3.0
-80 0.00 -135 -0.2
-70 0.01 -125 -0.9 2.0

-60 0.04 -115 -4.3 1.0


-50 0.19 -105 -20.3 0.0
-40 0.89 -95 -84.5 -100 -50 0 50 100
-30 2.80 -85 -238.0 mV
-20 4.71 -75 -353.3
-10 5.41 -65 -351.5
0 5.56 -55 -305.9
10 5.59 -45 -251.7

pA
200
20 5.60 -35 -196.0
30 5.60 -25 -140.0 100
40 5.60 -15 -84.0 0
50 5.60 -5 -28.0 -100 -50 0 50 100
-100
60 5.60 5 28.0
70 5.60 15 84.0 -200
80 5.60 25 140.0 -300

-400
mV
Studio dell’inattivazione allo stato stazionario

0 mV
0

-20
1.2 1
-40

Probabilità gate h aperta


Vm (mV)

1.0

Corrente di Na (nA)
-60

-80 0.8
-100 0.6 0.5
-120
0 1 2 3 4 5 6 7 0.4
Tempo (ms)
0.2 0.2
0.0
0.0 0
-0.2
-120 -100 -80 -60 -40 -20 0
-0.4
Potenziale di condiz. (mV)
INa (nA)

-0.6

-0.8
Se si ipotizza che il processo di inattivazione
-1.0 sia regolato da un’unica gate (h), i valori in
-1.2 grafico sono proporzionali alla probabilità di
0 1 2 3 4 5 6 7 trovare tale gate aperta allo stato stazionario
Tempo (ms)
Confronto della voltaggio-dipendenza di gK e gNa

1.0

Conduttanza g 0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

-60 -40 -20 0 20 40 60


Vm (mV)
Nota:
A parità di conduttanza, è la driving force che determina
l'andamento della relazione I/V
EA =+55mV EB=-80mV
Vm g (nS) Vm -EA IA (pA) Vm -EB IB (pA)
-80 0.00 -135 -0.2 5 0.0
-60 0.04 -115 -4.3 25 0.9
-40 0.89 -95 -84.5 45 40.0
-20 4.71 -75 -353.3 65 306.2
0 5.56 -55 -305.9 85 472.8
20 5.60 -35 -196.0 105 587.9
40 5.60 -15 -84.0 125 700.0
60 5.60 5 28.0 145 812.0
80 5.60 25 140.0 165 924.0

1000

800 EA=+55mV
EB=-80mV
600
Corrente (pA)

400

200

-200

-400
-100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100
Voltaggio (mV)
HHsim: Graphical Hodgkin-Huxley Simulator

http://www.cs.cmu.edu/~dst/HHsim/
Esercizio
Usando il programma di simulazione H&H, progettare un
esperimento di voltage-clamp per determinare:

(a) Il potenziale di inversione della corrente del Na

(b) Il potenziale di inversione della corrente del potassio


Calcolo del potenziale di inversione (equilibrio) della corrente di K+
80
60
40
Vtail (mV) IK ist. (nA) V-EK
 EK < -60
Voltaggio (mV)

20 -60 348 -60-EK >0


0
-20 0 5 10 15 20 25 30 35 -70 60 -70-EK >0  EK < -70
-40 -80 -216 -80-EK <0  EK > -80
-60
-80
-100
Tempo (ms)
Relazione IK ist. - Voltaggio

5000 400
4000 EK 300

IK istantanea (nA)
3000 200
2000
IK (nA)

100
1000
0
0
-1000 0 5 10 15 20 25 30 35 -85 -80 -75 -70 -65 -60 -100 -55
-2000 -200
-3000
-300
Tem po (m s)
Voltaggio (mV)

500
+348 nA (-60 mV)
400
300
+60 nA (-70 mV)
200
100
IK (nA)

0
-100 24 25 26 27 28 29 30
-200 C O
-300
-400
-216 nA (-80 mV)
-500
Tempo (ms)