PRUEBAS SEROLOGICAS

 Las Pruebas serológicas son técnicas de diagnóstico de laboratorio con fundamento

inmunológico basadas en la detección de una reacción Antígeno-Anticuerpo.
 Son muy útiles porque nos permiten identificar Antígenos (Ag) en una muestra
disponiendo de Anticuerpos (Ac) conocidos y viceversa

CLASIFICACIÓN DE LAS REACCIONES SEROLÓGICAS

 INMUNOFLUORESCENCIA
Definición: Técnica de biología molecular que consiste en incubar una muestra
con un anticuerpo (Ac) conjugado con colorantes fluorescentes (Fluoroformos)
que detecte antígenos (Ag) específicos en células o tejidos.

Principio
Fluorescencia. Es la propiedad de una sustancia de emitir luz cuando es expuesta a
radiaciones de baja longitud de onda y alta energía (UV – Rx). Las radiaciones absorbidas
(invisibles al ojo), son transformadas en luz visible, o sea de una longitud de onda mayor
a la incidente.

Detección: Cuando la reacción es positiva y se expone a luz ultravioleta se

producirá fluorescencia observable bajo el microscopio de inmunofluorescencia

Hay 2 tipos: IFD e IFI

alta sensibilidad
 INMUNOFLUORESCENCIA
FLUOROCROMOS
Sustancias que sometidas a una fuente luminosa absorben luz de una determinada
longitud de onda y emiten una radiación luminosa de onda mayor
Los más utilizados son el ISOTIOCIANATO DE FLUORESCEINA y la RODAMINA (6G, B)

Microscopio de fluorescencia consta de:

 Lámpara de vapor de mercurio: fuente de los rayos UV
 Filtro excitador, situado antes del objeto, que permite pasar los UV y detiene la luz
visible
 Filtro de detección, entre el ocular y el objetivo, que detiene los rayos UV y permite el
paso de la luz fluorescente emitida
 INMUNOFLUORESCENCIA
Pasos claves de una inmunofluorescencia

2.Permeabilización 4.Inmunodetección
• Albúmina
• Glutaraldehído bovina sérica
• Paraformaldehido • Triton X-100 • IFD
• Gelatina de
• NP40 pescado • IFI
1.Fijación
3.Bloqueo

1.Fijación: Preservar la localización, composición y estructura del material

biológico a analizar manteniendo lo más fielmente posible a la situación que
existe in vivo.
 INMUNOFLUORESCENCIA
Pasos claves de una inmunofluorescencia

2.Permeabilización. Permite el ingreso de los anticuerpos a la célula si queremos

detectar estructuras internas de la célula
Se utilizan generalmente detergentes no iónicos que solubilizan los lípidos de la
membrana produciendo de manera irreversible o reversible poros en la membrana (por
ejemplo Tritón X‐ 100, NP40).
 INMUNOFLUORESCENCIA
Pasos claves de una inmunofluorescencia

3.Bloqueo.
Su función es impedir interacciones inespecíficas de los anticuerpos con
el material biológico a analizar y así reducir la marcación inespecífica

4.Inmunodetección: Los anticuerpos son

proteínas que tienen la capacidad reconocer
específicamente y unirse con alta afinidad a
otras moléculas (antígenos). La molécula que
es reconocida por los anticuerpos se
denomina antígeno. Cada antígeno tiene al
menos un epitope o región reconocida por un
anticuerpo.
 INMUNOFLUORESCENCIA
Inmunofluorescencia Directa (IFD)

Se basa en la utilización de un Anticuerpo primario específico marcado con

fluorocromo. Se utiliza para la detección de antígenos en los microorganismos
o los tejidos utilizando el anticuerpo primario marcado. La muestra problema
donde se quiere determinar el microorganismo, bacteria, o tejido se extiende
en una porta, se añade el anticuerpo marcado y tras lavado, se observa al
microscopio de fluorescencia.

desconocido
 INMUNOFLUORESCENCIA
Inmunofluorescencia Indirecta (IFI).

Se basa en la utilización de un Anticuerpo secundario anti Ig marcado con

fluorocromo. Se usa para la detección de anticuerpos en suero

1. Basado en la reacción de los anticuerpos de 2. El complejo antígeno-anticuerpo es revelado

la muestra con el antígeno unido a la
superficie del portaobjeto o soporte. En un
primer paso los anticuerpos específicos
presentes en la muestra (problema)
reaccionan con el antígeno del soporte
(conocido, para los Ac a determinar). Las
inmunoglobulinas no unidas son
eliminadas en el proceso de lavado
mediante globulina antihumana o Ac Anti-
inmunoglobulina humana marcados con
fluoresceína visualizable mediante microscopio
de fluorescencia. La detección tiene mayor
sensibilidad (que la directa) por presentar una
amplificación de señal debida a la unión de dos o
más Ac 2º por cada 1º.

conocido
 INMUNOFLUORESCENCIA

Se utiliza por ejemplo para el diagnóstico de: Se utiliza por ejemplo para el diagnóstico de:
 Bacterias patógenas en heces  Treponema pallidum
 Virus de la rabia en cortes histológicos  Toxoplasma gondii
del cerebro  Coxiella burnetii
 Virus en secreciones respiratorias  Rickettsia conorii
 Leishmania
 LES
 HEMAGLUTINACIÓN
Reacciones de Aglutinación
Definición: Fenómeno que se observa cuando se mezclan ANTÍGENOS PARTICULADOS en
suspensión con suero que contenga Ac frente a ellos
 El resultado de la unión Ag-Ac es la FORMACIÓN DE AGREGADOS Ó AGLUTINADO DE
PARTÍCULAS DETECTABLE (BACTERIAS, CÉLULAS, PARTÍCULAS INERTES)
 Los antígenos más frecuentes implicados forman parte de bacterias, células como
hematíes (hemaglutinación) u otras partículas como en el caso de antígenos unidos a
partículas inertes.
 Los Ac IgM son los más eficaces en la aglutinación.
 HEMAGLUTINACIÓN
Clasificación de las reacciones de Aglutinación

AGLUTINACIÓN PASIVA O INDIRECTA.

 Se basa en que los antígenos solubles pueden fijarse por diversos
procedimientos sobre partículas inertes: Hematíes, colesterol,
partículas de látex .
 Las partículas recubiertas de Ag reaccionaran con los Ac de la
muestra.
 Su característica diferencial con respecto a la aglutinación directa es
que el antígeno no forma parte natural de la partícula aglutinada sino
que ha sido fijado o adsorbido a ella.
 HEMAGLUTINACIÓN
Este tipo de aglutinación se lleva a cabo utilizando eritrocitos
recubiertos de antígenos, o anticuerpos acoplados de manera
espontánea (adsorción pasiva) o mediante un acoplamiento
químico, utilizando diversas sustancias

Algunas de las substancias que se absorben para la

hemaglutinación:
• Antígenos de Escherichia coli.
• Antígenos de Yersinia.
• Lipopolisacáridos de Neisseria meningitidis.
• Antígenos de Toxoplasma.
• Derivado proteico purificado (DPP).
• Endotoxina de especies de Micoplasma.
• Virus.
• Antibióticos, especialmente penicilina.
• Ovalbúmina.
• Albúmina sérica bovina.
• Haptenos.
• Antígenos de polen.
• Gonadotrofina coriónica.
HEMAGLUTINACIÓN
CARACTERIZACIÓN DE LOS VIRUS DEL DENGUE

Equipos:
Centrífuga refrigerada
Placas en fondo U desechables
Pipetas eppendorf de 25 y 50ul. Pipeta
multicanal de 25-250ul.
Cristalería

Reactivos
Solución de Alsever:
 Dextrosa 20.5 g
 NaCl 4.2 g
 Ácido cítrico(C6H8O7.H2O) 0.55 g
 Citrato de sodio(Na3C6H5O7.2H2O)
8.0 g
 H2O destilada a completar 1000 Ml
 HEMAGLUTINACIÓN
Hemaglutinación (HA)
 Hidratar los antígenos liofilizados y mantenerlos a 4oC por al
menos 1 hora, pero preferiblemente toda la noche.
 Preparar diluciones seriadas (al doble) en las placas
previamente rotuladas, a los diferentes pH de trabajo (el pH
óptimo para el antígeno, el valor superior de pH y el valor
inferior). De no conocer el pH óptimo de cada antígeno, debe
titularse a todos los pH.
 Añadir 0,025 mL de BABS a cada pozuelo de la placa.
 Añadir 0,025 mL del antígeno al primer pozuelo de cada hilera.
 Hacer diluciones al doble comenzando por el primer pozuelo y
utilizando pipetas “multicanal”. 6. Agitar la placa.
 Añadir 0,025 mL de la solución glóbulos rojos al 0.5%
preparados en cada uno de los diferentes pH.
 Agitar y dejar reposar de 30-40 minutos a temperatura
ambiente.
 Leer la hemaglutinación (una capa fina y bien distribuida de
glóbulos).
HEMAGLUTINACIÓN

Patrón de hemaglutinación:
 No hemaglutinación: Los glóbulos rojos
sedimentan en el fondo del pozuelo
observándose como un botón.
 Hemaglutinación parcial: Se observa un
anillo de células aglutinadas alrededor de
un botón en el centro. No se lee como
punto final de hemaglutinación.
 Hemaglutinación completa: Los glóbulos
rojos dan una capa fina y bien distribuida
en el pozuelo. Se lee como punto final de
la hemaglutinación.
 HEMAGLUTINACIÓN
Inhibición de la hemaglutinación (IH)
1. Rotular las placas con el número de los sueros a probar y el
antígeno a utilizar. Es recomendable usar una placa por antígeno. Los
sueros son probados utilizando 4, 8 ó 12 diluciones de los mismos
contra el antígeno; dependiendo esto del tipo de suero, del
propósito y de la experiencia del laboratorio en el diagnóstico o
encuestas serológicas. Los pares de suero de un paciente deben ser
tratados y probados en el mismo ensayo.
2. Añadir 0,025 mL de BABS a cada pozuelo.
3. Añadir 0,025 mL del suero a titular en el primer pozuelo de cada
hilera.
4. Diluir los sueros con pipeta “multicanal”.
5. Añadir a cada pozuelo 0,025 mL de la dilución de antígeno que
contiene 8 unidades hemaglutinantes.
6. Agitar y dejar reposar a temperatura ambiente durante 45
minutos.
7. Añadir 0,05 ml de glóbulos rojos diluidos en el pH óptimo para el
virus.
8. Agitar y dejar reposar a temperatura ambiente durante 30
minutos.