REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

PCR
 Reacción en cadena de la polimerasa – PCR
DEFINICION
Técnica que nos permite amplificar in vitro selectivamente secuencias especificas de ADN (fragmento de ADN
de interés) permitiendo generar cantidades ilimitadas de éste fragmento para su posterior visualización, análisis y
cuantificación

Fragmento de ADN
de interés PCR

amplificación

permite la obtención de un millón

de copias del fragmento en pocas horas
(AMPLICONES)
 Invención
En abril de 1983, Kary Banks Mullis(Dic 28, 1944) da a
conocer la técnica de reacción en cadena de la
polimerasa

Bioquímico norteamericano.

Criado en Carolina del Norte EEUUAA en una granja.

Trabajo en cardiología pediátrica, farmacéutica, sintesis proteica.

Trabajo para Cetus donde divisó el mecanismo general subyacente de la PCR.

En 1989, Science seleccionó el PCR como el principal desarrollo científico, y la Taq polimerasa como la
molécula del año.

En 1993, Kary Mullis recibió por este descubrimiento el Premio Nobel de Química.

Utilizo el PCR para amplificación del gen de beta-hemoglobina humana, y el diagnostico prenatal de
anemia falciforme.

Niega que el SIDA sea causado por HIV y niega el calentamiento global.
 REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
FUNDAMENTO
• Amplificación enzimática de un fragmento de DNA
• (simulando una replicación natural del DNA “in vitro”)

LA SINTESIS DE LOS ACIDOS NUCLEICOS ES SIEMPRE DE 5´ 3´.

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

Primero, la fusión separa las dos cadenas de ADN a alta

temperatura (~100°C)
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

 Síntesis por DNA polimerasa

5’ 3’
 -T A C G
 -A T G C A T G C A T G C * *

Cortos primers de ADN específicos hibridizan con la cadena que

tiene que ser copiada
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

 Síntesis por DNA polimerasa

5’ 3’
 -T A C G T
 -A T G C A T G C A T G C *
*
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

 Síntesis por DNA polimerasa

5’ 3’
 -T A C G T A
 -A T G C A T G C A T G C *
*
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

 Síntesis por DNA polimerasa

5’ 3’
 -T A C G T A C
 -A T G C A T G C A T G C * *
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

 Síntesis por DNA polimerasa

5’ 3’
 -T A C G T A C G
 -A T G C A T G C A T G C * *
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

 Síntesis por DNA polimerasa

5’ 3’
 -T A C G T A C G T
 -A T G C A T G C A T G C * *
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

 Síntesis por DNA polimerasa

5’ 3’
-T A C G T A C G T A


 -A T G C A T G C A T G C *
*
 Etapas de la PCR
partiendo de un DNA molde una enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a
partir de la zona de doble cadena originada por la unión de los cebadores al molde.
Un ciclo de “PCR” incluye 3 pasos básicos que se repiten 25-30 veces o más
1. Denaturalización: Apertura de la doble cadena
2. Alineamiento o Hibridacion: Anillaje de primers
3. Extensión: Generación de la nueva cadena

Desnaturalización
30 ciclos
100 Desnaturalización
94 oC 94 oC
Temperatura

Extension
72 oC
50 50-60oC
Anillaje

0
Tiempo
Termocicladores
los cambios de temperatura constituyen la base para que se completen los pasos necesarios.
 Desnaturalización
En primer lugar es necesario que el DNA se desnaturalice Los puentes de hidrógeno entre las dos hebras
de ADN se rompen con la finalidad de separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla.
Mas habitualmente se usa una temperatura de 94˚C - 95˚C, por 45 segundos 1 minuto –si G+C < 55% La
temperatura y el tiempo a la cual se decide realizar la desnaturalización depende, por ejemplo, de la
proporción de G+C que tenga la hebra, como también del tamaño del genoma
2. Apareamiento, Hibridacion o Alineamiento: (Unión del primer)
El siguiente paso consiste en un descenso de la temperatura para permitir que los cebadores “primers” previamente
diseñados, se unan (se apareen) por enlaces puentes de hidrogeno a su secuencia complementaria de la hebra sencilla del
DNA molde en lugares específicos (se unen a las zonas 3´ complementarias que flanquean el fragmento que queremos
amplificar) .
Para esto, se baja la temperatura entre 35 y 60ºC -ej: 55˚C por 30 segundos-. La temperatura y el tiempo puede variar entre
cebadores según sea el caso. debe ser calculada o determinada empíricamente para cada par de primers. Es especifica de la
reaccion.
Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.

3’OH 5’

5’ 3’OH
3. Polimerización o Extensión. (La Polimerasa de DNA extiende los “primers”)
Actúa la ADN polimerasa, sintetizando una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo
nuevos dinucleotidos trifosfato (dNTP's) presentes en el medio en dirección de 5’a 3’ leyendo el DNA molde
de 3’a 5’, partiendo del primer como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN.
La temperatura para este paso depende de la ADN polimerasa que usemos, generalmente superior a los 70ºC
por ejemplo: 72°C para Taq polimerasa
El tiempo de extensión depende tanto de la ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de
ADN que se va a amplificar.
Regla comúnmente usada en su temperatura óptima:
la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto.

Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.

 Polimerasa

Primers

Primers
Polimerasa
 ¿Qué se ha obtenido tras un ciclo de PCR?

1er CICLO
Únicamente una copia de un pequeño
fragmento del ADN molde.

2do CICLO

El tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de 3er CICLO

su cantidad original se encuentra disponible para ser
nuevamente replicado en un segundo ciclo. Múltiples ciclos darán un incremento exponencial en el número
de copias
 CRECIMIENTO EXPONENCIAL DE LA PCR

Numero de ciclos
Es común que al finalizar todos los ciclos se realice un último alargamiento por 5 min. a 72ºC, para
asegurarse que todos los productos de amplificación estén completamente terminados
y tengan, por ende, exactamente la misma longitud
La cantidad de DNA dobla teóricamente con cada ciclo de PCR, Después de
cada ciclo, la cantidad de DNA es dos veces la del ciclo
anterior

Después de:
- 2 ciclos tenemos 2 x 2
- 3 ciclos - 2 x 2 x 2
- 4 ciclos 2 x 2 x 2 x 2
Así, después de ciclos de N ciclos
tendremos 2N

Pero la reacción no puede

mantenerse indefinidamente, se
alcanza una fase de meseta, según lo
demostrado en las cifras que
aparecen en rojo.
 Pérdida de eficiencia de PCR
Fase de
Fase lag meseta Factores que llevan a la
pérdida de eficiencia de
PCR luego de varios ciclos:
[ADN]

 Disminución de actividad
de la polimerasa.
 Disminución de la
disponibilidad de dNTPs
y cebadores.
10 15 20 25 30  Disminución de la
Nº de ciclo disponibilidad de Mg2+,
para el funcionamiento
Fase de la enzima.
exponencial
En este primer ciclo, los
fragmentos generados no
tienen el mismo tamaño: la
copia de cada una de las
cadenas se inicia, a partir del
extremo 3’, en el punto en el
que el cebador hibrida con el
DNA molde y termina en el
momento en el que la enzima
polimerasa no es capaz de
añadir más nucleótidos (es
decir, que la nueva cadena
formada no tiene un tamaño
definido).
¿Qué componentes son necesarios para la
PCR?
 Componentes del sistema de PCR: ADN molde
El DNA a partir del cual queremos obtener una copia de un fragmento. Puede ser
simple o doble cadena. El molde también puede ser ARN.
La concentración de la DNA molde en la reacción depende de la fuente utilizada
(muestra de partida).Demasiada cantidad de ADN puede inhibir la reaccion
El mínimo va de 1-100 ng. y el máximo entre 400-500 ng
El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000 nucleótidos de longitud.
En caso de desear amplificar una secuencia de ARN se debe utilizar primeramente
una transcriptasa reversa.
el molde no debe competir con los primers en el alineamineto, que puede ocurrir
por excesiva cantidad de templado inicial, afectando la fidelidad del producto.

No necesariamente puro pero deben tenerse en cuenta los

posibles contaminantes presentes en el ADN molde, que pudieran
inhibir la ADN pol y disminuir la eficiencia de reacción:
 Urea
 detergentes
 Acetato de sodio
 Agarosa
 Fenol
 EDTA
 Componentes del sistema de PCR: cebadores Se conoce su secuencia
Requieren de un cuidadoso diseño
 Longitud de la región complementaria al ADN molde de entre 18-25pb.
 Deben ser específicos.
 Moléculas lineales con un grupo hidroxilo en el extremo 3´
 No deben presentar auto-complementariedad.
 No deben ser complementarios entre ellos.
 El contenido de G+C debe estar entre el 40-60%.
 No largas secuencias de una sola base
 El Tm de los cebadores no debe diferir en más de 5ºC.
 La diferencia entre el Tm de los primers y del amplicón no debe superar los
10ºC.
 Su concentración debe ser de entre 0.1-1μM (concentraciones excesivas
pueden dar lugar a inespeficidad de amplificación).
Tm = 2C (A + T) + 4C (G + C) 2
 Evitar las secuencias repetidas
5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’ 5’-NNNNNNNNTATA-3’
5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’ 3’-ATATNNNNNNNN-5’

3´ repetido
5´ 3´ PCR
3´ 5´

5´ 3´
3´ 5´

Dímero de primer
Evitar las secuencias repetidas
5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´ 5´-TATANNNNNNNN-3´
5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´ 3´-NNNNNNNNATAT-5´

5´ repetido
5´ 3´ PCR
3´ 5´

5´ 3´
3´ 5´

no hay extensión
Evitar las secuencias repetidas
5’-NNNNNNNNNNNGCATGC-3’ 5’-NNNNNNNNNNNGCA
5’-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 3’-CGT

Formación de horquillas
5´ PCR
3´

5´
3´ 5´ 3´

Productos de PCR no deseados

 Componentes del sistema de PCR: polimerasa
termoestable
Las ADN polimerasas termoestables presentan las siguientes
características:
 Polimerizan en dirección 5’→ 3’.
 Necesitan de un extremo 3’-OH libre para comenzar la
polimerización.
 Incorporan dNTPs por complementariedad en una cadena
que sirve de molde.
 Necesitan la presencia de Mg para funcionar.
 Son capaces de resistir altas temperaturas por períodos
considerables.
1-2 unidades de enzima /50 l de reacción
Características principales a considerar al elegir la enzima:
Fidelidad:
Concentracion Ion Mg y de los dNTPs
La Taq polimerasa Concentración recomendada de 1 a 2,5 unidades por 100 ul.
En un principio, la polimerasa de DNA de la bacteria E. coli, pero esta es sensitiva a alta temperatura
Se reemplazo por la enzima de la bacteria “Thermus aquaticus” conocida como Taq pol aislada en 1976
Es termoestable y actúa en la presencia de iones
de magnesio a temperaturas elevadas.
JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Aug. 1969, p.
289-297 Vol. 98, No. I
Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a
Nonsporulating Extreme Thermophile
THOMAS D. BROCK AND HUDSON FREEZE
Department of Microbiology, Indiana University,
Bloomington, Indiana 47401
The isolation of a new thermophilic bacterium,
Thermus aquaticus gen. n. And sp. n., is
described. Successful enrichment requires
incubation at 70 to 75 C, and the use of nutrient
media relatively dilute with respect to the
organic components.
Strains of T. aquaticus have been isolated from
a variety of thermal springs in Yellowstone
National Park and from a thermal spring in
California. The organism has also been isolated
from man-made thermal habitats, such as hot
tap water, in geographical locations quite
distant from thermal springs. Isolates of T.
Aquaticus are gram-negative nonsporulating
nonmotile rods which frequently form long
filaments at supraoptimal temperatures or in the
stationary phase. The optimum temperature
for growth is 70 C, the maximum 79 C, and
the minimum about 40 C. The generation time
at the optimum is about 50 min.
 Componentes del sistema de PCR: polimerasa
termoestable
Existe una variedad de enzimas con características diferentes, según
la finalidad de la PCR a realizar.

ADN polimerasa Vida media A) B) C)

(95ºC)
Taq (Thermus aquaticus) 40 + - -

Vent (Thermococcus litoralis) 400 - + -

Pfu (Pyrococcus furiosus) 120 - + -

Tth (Thermus thermophilus) 20 + - +

A) Actividad exonucleasa 5’ → 3’.

B) Actividad exonucleasa 3’ → 5’.
C) Actividad de transcriptasa inversa.
 Componentes del sistema de PCR: dNTPs Desoxinucleotidos
Generalmente se utilizan concentraciones equimolares de los 4
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) en concentraciones que varían
entre 200 – 250 μM de c/u. cantidad suficiente para que se
logre la extensión a lo largo de todos los ciclos
Concentraciones mayores a 4mM inhiben la PCR por
quelación de Mg2+.
No deben estar en exceso para que los iones
Mg++ no estén formando complejos con los
dNTPs. Puede inhibir a la polimerasa
Su concentración debe ser proporcional a la
del Mg
 Otros Componentes
Agua
Buffer
Iones divalentes. (Mg2+)
y (MgCl2).
Agua (grado biología molecular)

• Agua libre de RNAsas y

DNAsas

• Provee el medio en el cual

se llevaran a cabo las
reacciones para la
replicación del material
genético
Tampón y Sales

Deberá tener un pH óptimo para que la

enzima actúe.
Tris HCl pH 8 .8,8
Estabiliza a la DNA polimerasa
Amortigua pH
Aportando iones necesarios (KCl)
proporcionan la fuerza iónica adecuada
para la actividad de la enzima
Puede contener aceleradores o
adyuvantes (Tween 20)
Promotores de la reacción:
DMSO
Gelatina
Catión divalente Mg++ es un cofactor de DNA polimerasas estimulan a la
enzima Taq polimerasa para que incorpore los dNTP´s.

Determinar la [Mg++] óptima es uno de los pasos más

importantes en la puesta a punto de una PCR.

Muy poco – la polimerasa no funciona

correctamente, afectando el rendimiento
de la reacción

Mucho – favorece el alineamiento de los

primers a lugares que no son 100 %
complementarios, afectando la especificidad y
el rendimiento de la reacción
 Termociclador
La PCR se realiza en un
“Thermo Cycler”
Termociclador.

Es una máquina que

puede ser programado
para calentarse y
enfriarse en periodos
cortos de tiempo de
forma ciclica
 ANALISIS DE LA PCR
El DNA clonado es colocado en un gel de agarosa, para realizar el corrimiento electroforético y observar con luz ultravioleta.

Separación de moléculas en un campo eléctrico

Electrodo (+)
Cámara de electroforesis
Camas para preparación del gel
de agarosa

Fuente de poder

Electrodo (-)
 Ejemplos de corridos de electroforesis

Con marcador de 100pb

Con marcador de 50pb
M 1 2 3 4 M
M 1 2 3 4 5 6 7

300pb 400pb
250pb

150pb

100pb

400pb
350pb 300pb
250pb
 • Sensibilidad • Sin embargo, el hecho
de que el método
• La PCR puede amplificar tenga una sensibilidad
secuencias a partir de tan elevada significa
cantidades ínfimas de ADN también que se deben
diana, incluso a partir de extremar las
ADN contenido en una sola precauciones para
célula. evitar la
• La elevada sensibilidad ha contaminación de la
VENTAJAS permitido:
Desarrollo de nuevos
muestra con ADN
extraño.
métodos para el estudio
de la patogénesis
molecular
La aparición de numerosas
aplicaciones (ciencia
forense, diagnóstico,
estudios de paleontología
molecular, etc) donde las
muestras pueden contener
muy pocas células.
 • Para poder construir
• Necesidad de oligonucleótidos
disponer de específicos que
información actúen como
sobre la cebadores para la
secuencia del amplificación selectiva
de una secuencia
ADN diana particular de ADN se
necesita:
• Disponer de alguna
DESVENTA información previa
sobre la propia
JAS DE secuencia a
amplificar.
“PCR” • La región de interés ya
debió haber sido
parcialmente
caracterizada, a
menudo mediante la
aplicación de métodos
de clonación basados
en sistemas celulares.
 • La clonación del ADN en
DESVENTAJAS células pasa por la
• Infidelidad en replicación del ADN in vivo,
la replicación proceso asociado a una
del ADN gran fidelidad de copiado
debido a la existencia, en la
célula, de mecanismos de
lectura y corrección de
errores.
• Sin embargo, cuando el ADN
se replica in vitro la tasa de
errores cometidos durante
el copiado se dispara.
Tamaño de amplificación limitado
Aplicaciones

 Detección de agentes infecciosos como: hepatitis B y C, papiloma virus, HIV,

entre otros
 Análisis de DNA de cualquier organismo vivo o muerto, análisis de fósiles
 Mutagénesis
 Expresion genética
 Marcadores moleculares
 Investigación forense
 Pruebas de paternidad
 Identificacion y aislamiento de genes
DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES
•INVESTIGACIONES FORENSES
Aplicaciones
Criminalística
• Ejemplo de un caso de
criminalística resuelto utilizando
electroforesis en gel vertical de
acrilamida.

• Si se observan los patrones

bandas podrá comprobarse como
los perfiles obtenidos en las
manchas de sangre encontradas
en el sombrero (Hat) y pantalón
(Jeans) del sospechoso (S)
coinciden con el perfil genético
de la víctima (V)
Aplicaciones en el diagnóstico médico
Existen métodos de detección por PCR de agentes infecciosos como
los virus de las hepatitis B y C, del papiloma humano, de Epstein Barr y
citomegálico.
Es posible detectar regiones del genoma del virus de la
inmunodeficiencia humana (HIV) a partir de sangre extraída de
pacientes seropositivos.
La técnica PCR ha facilitado enormemente el diagnóstico de
enfermedades hereditarias como hemoglobinopatías (talasemias y
anemia falciforme), la fenilcetonuria, las hemofilias A y B, la
deficiencia de alfa 1 antitripsina, la distrofia muscular y la fibrosis
quística.
En enfermedades oncológicas pueden detectarse mutaciones de
oncogenes.
Se han implementado métodos que utilizan la PCR destinados a la
evaluación del riesgo de padecer trastornos autoinmunes, tales como
diabetes de tipo I, enfermedad celíaca, pénfigo vulgaris, miastenia
gravis y esclerosis múltiple.
Detección de cepas resistentes a antibióticos
Aplicaciones médicas
 En Oncología, la detección de translocaciones, mutaciones,
deleciones, etc., aporta un método más objetivo y sensible al
establecer un diagnóstico, dado que el estudio «clásico» de las
neoplasias se fundamenta en la identificación histopatológicade
células malignas las cuales, sin embargo, sereconocen sólo si al
menos 1%-10% de las células son neoplásicas.