UNIDAD DIDÁCTICA 2

Principios básicos de fotometría

y espectrofotometría
Índice
1. Introducción
2. Clasificación de las técnicas espectroscópicas
3. Naturaleza de las radiaciones electromagnéticas
4. Espectros de absorción y de emisión
5. Espectroscopia de absorción UV-visible
6. Espectrofometría de absorción atómica
7. Espectrofotometría de emisión
8. Aplicaciones de los distintos tipos de espectrofotometría
1. Introducción:
• Uno de los objetivos de un laboratorio clínico consiste en determinar la concentración de
sustancias ( sustratos, enzimas, metales.. ) que se hallan disueltas en algún líquido biológico.

• Para el análisis cualitativo y cuantitativo de estas sustancias se emplean las regiones ultravioleta y
visible del espectro electromagnético.

• Se miden los efectos que producen la interacción de las radiaciones electromagnéticas (

regiones ultravioleta y visible ) con la materia (átomos, moléculas o iones) presentes en la
muestra o solución. Si la energía radiante es la radiación electromagnética se denomina
espectrofotometría o métodos ópticos espectroscópicos.
• Las técnicas espectroscópicas utilizan la medida de los efectos que
produce la interacción de las radiaciones electromagnéticas con la
materia
2. Clasificación de las técnicas
espectroscópicas.

• Emisión
• Absorción
Según la interacción de la radiación
• Dispersión
con la materia
• Reflexión
• Difracción
• Refracción
•…
3. Naturaleza de las REM
• Las radiaciones electromagnéticas (REM) son una propagación ondulatoria de energía eléctrica y
magnética ( Está compuesta por campos eléctricos y magnéticos). Las REM se comportan como ondas y
como partículas.

• Como ondas, cada REM se define según estos parámetros:

 Longitud de onda (l):
- Distancia entre dos máximos de un ciclo completo del movimiento ondulatorio. Se mide en nm. ( 1 nm=10 -9 m)
 Frecuencia (n):

- Es proporcional a la energía de la partícula.

- Es el número de ciclos por segundos y es inversa a la longitud de onda.
- Se mide en ciclos o hertz (s-1).
- n = c/l (c=velocidad de la luz = 300.000 km/s)
• Además del carácter ondulatorio de la REM, podemos decir
que está constituida por un conjunto de partículas (carácter
corpuscular) llamadas fotones que constituyen el “quanto de
energía” o cantidad mínima de radiación.

• La energía de cada radiación viene determinada por la

ecuación de Max Planck:

E = h·n.

Donde h (= 6´62 · 10-27 ergios/s) es la constante de Planck.

Por lo que E = h ·c / l.
• La energía de una radiación electromagnética es
inversamente proporcional a la longitud de onda.
• Por tanto podemos concluir que:
 Cuanto menor sea la l y mayor sea la frecuencia, mas energética
será la radiación y por tanto más peligrosa.
 Cuanto mayor sea la l y menor sea la frecuencia menos
energética será la radiación y por tanto menos peligrosa.
Espectro electromagnético

Es el conjunto de las REM.

Estas se pueden agrupar en regiones, que son intervalos de longitudes

de onda.

Las que más interesan en el laboratorio son las regiones:

• Ultravioleta (180-390 nm)

• Visible (390-700 nm).

• Cada longitud de onda de la región visible
corresponde a un color determinado. No hay
límites definidos entre colores contiguos, sino una
variación gradual a lo largo de todo el espectro.

• Las regiones más utilizadas en el laboratorio de

análisis clínico y farmacéutico son las
correspondientes al UV-V, es decir, las
comprendidas entre 220 y 700 nm.

• La espectrofotometría que trabaja con el visible se

llama también COLORIMETRÍA.
Naturaleza de las REM
Estudio de la interacción de la
energía radiante con la
materia (Radiación
electromagnética)

REM longitud de onda

energía

ESPECTRO
ELECTROMAGNÉTICO
4.Espectros de absorción y de emisión.

Los fenómenos de absorción, emisión, etc. son la

base de las diferentes técnicas
espectrofotométricas.

PROCESO DE ABSORCIÓN:
Cuando un haz de luz interacciona con una partícula (átomo, molécula o
ión) que se encuentra en "estado de reposo" o "estado fundamental"
ésta, absorbe energía y pasa a lo que se denomina "estado excitado" o
estado energético superior, es decir, los electrones de los átomos de la
partícula pasan a órbitas superiores de mayor energía.
• En general, cada sustancia química al poseer una estructura molecular
única tiene un comportamiento frente a una radiación característico que
va a depender de la disposición de sus átomos y enlaces (sólo absorberá de
una manera máxima una radiación) = Este comportamiento característico
nos permite identificarla. “Espectro de absorción característico”

Ejemplo. la glucosa presenta una absorción máxima con una l de 500

nm.

• Si hacemos incidir un haz de luz blanca sobre una solución que absorbe a
una longitud de onda determinada, ésta transmitirá todas las demás
longitudes de onda, apareciendo a la vista el color complementario del que
corresponde a la longitud de onda absorbida.
Espectros de absorción y de emisión
λ Región Absorbido Complementario
180-220 Uv lejano No visible ------
220-340 Uv cercano No visible ------
340-430 Violeta Amarillo-verdoso
430-475 V Azul Amarillo
475-495 I Verde-azul Naranja
495-505 S Azul-verde Rojo
505-555 I Verde Púrpura
B
555-575 Verde-amarillo Violeta
L
575-600 Amarillo Azul
E
600-620 Naranja Azul-verde
620-700 Rojo Verde-azul
• Cuando se observe de un color determinado al ojo
humano, corresponderá al complementario de la l
absorbida.
• Los colores que el ojo humano percibe, pueden producirse de dos maneras:

 Por un proceso de adición, como sucede con la luz blanca que se

produce por la unión de todos los colores del espectro, o por la mezcla
de dos o más colores.

 Por un proceso de sustracción o absorción selectiva, como por

ejemplo con los líquidos coloreados, que absorben selectivamente
determinadas l y dejan pasar otras, las complementarias, que son las
que se perciben.
ADICCIÓN Y SUSTRACCIÓN
• Cada compuesto coloreado (cromógeno) en disolución acuosa diluida tiene una
absorción típica en cada longitud de onda del espectro electromagnético

• Al gráfico que resulta de representar en el eje de ordenadas la absorbancia típica

frente a la longitud de onda en el eje de abscisas, se le denomina espectro de
absorción.
Utilidades de los espectros de absorción.
1. Seleccionar la l de máxima absorbancia, para
medir la concentración de esa sustancia con el
espectrofotómetro.
2. Identificación cualitativa de sustancias.
 OXIHEMOGLOBINA ANFETAMINA

A A

l l
• PROCESO DE EMISIÓN:

• Algunas sustancias tiene la propiedad tras

ser excitados de retornar a su estado
fundamental, produciendo una “ emisión”
de energía radiante. Podemos analizar esta
radiación emitida y registrarla mediante un
espectro de emisión. La luz emitida se
puede medir y ello constituye el principio
de algunas técnicas como la fotometría de
llama o la fluorimetría.