Universidad Autónoma de Nuevo León

Facultad de Ciencias Biológicas

Químico Bacteriólogo Parasitólogo

Biología molecular
PIA
PCR, RT-PCR, PCR tiempo real y Producción de
DNA complementario.
Gpo. 272 Equipo #5
Salazar Sánchez Alexis 1727521
Torres Ramírez Jesús Arnoldo 1741372
Zavala Campa Verónica Isabel 1732710

Docente: Dr. Edgar Mendoza Gamboa

San Nicolás De Los Garza, octubre del 2019
 INTRODUCCIÓN
Dado que la cantidad de pruebas genéticas realizadas ha aumentado
rápidamente en la última década, también lo han hecho las diferentes
metodologías de pruebas genéticas que se han utilizado. Para lo cual
actualmente se llevan a cabo métodos moleculares para realizar análisis directos
del ADN y se realiza cuando se conoce la secuencia del gen de interés.

Para realizar las pruebas, se pueden usar diferentes tecnologías moleculares,

como la secuenciación directa, los ensayos de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), la RT-PCR, PCR en tiempo real al igual
que la producción de DNA complementario. Estos últimos son de mayor
utilización en laboratorios médicos y a continuación se definirá cada uno de
ellos.
 PCR
(Reacción en Cadena de la Polimerasa)
Fundamento

Se basa en la amplificación de una secuencia específica del DNA esto se

repite durante varios ciclos en los cuales la secuencia blanco es copiada
tal cual es. Para realizar este ensamblaje se aprovecha la actividad de las
polimerasas las cuales sintetizan el DNA de las células.
Los elementos importantes en este proceso son el molde, la polimerasa, los
primers, los desoxirribonucleótidos trifosfatados, un buffer, agua y iones de
mg.
 Fases principales

Cada ciclo de esta técnica se realiza en tres fases:

 Desnaturalización
 Hibridación
 Extensión

Desnaturalización: La cadena de ADN es

calentada y separada a una temperatura de 95
grados durante 20-30 seg aunque este tiempo
puede variar según la secuencia. Al finalizar esta
fase el resultado será 2 cadenas templadas
Hibridación: En esta etapa los primers se
alinean al extremo 3 de las cadenas
previamente separadas con su secuencia
complementaria. Para poder realizar la unión
templado-primer, se requiere que el
termociclador tenga la temperatura
adecuada; por lo general esta oscila entre
los 50-60 grados

Extensión: En esta última fase la polimerasa

actúa sobre e complejo templado-primer e
inicia su actividad catalítica, esta agrega
dNTP’s con la finalidad de sintetizar cadenas
completas de ADN.
 Interpretación

• Al finalizar los ciclos se realiza una

electroforesis en gel con la finalidad de
saber si la reacción transcurrió
eficientemente. La electroforesis es la
separación de moléculas de un gran
tamaño por medio de una matriz solida la
cual funciona como un filtro el cual
separa las moléculas de acuerdo con su
tamaño y carga eléctrica.
Aplicaciones

Esta técnica es de gran ayuda en los laboratorios de investigación así

como en la industria ya que por medio de esta se pueden detectar
una gran variedad de patógenos en alimentos o productos para el
consumo humano lo cual evita las pérdidas para las grandes
industrias
RT-PCR
 Fundamento
Combina Combina la función
la de la
Esta basada en el uso de la actividad Retrotrancriptasa
de la RT y para sintetizar
retrotrancriptasa la cual cadenas de DNA
la PCR
produce una cadena de
cDNA que permitirá la
formación de una cadena Usualmente virus de Permite
de DNA en base a una los grupos VI y VII de analizar
Baltimore, así como muestras
cadena de mRNA, así analizar muestras de RNA
obteniendo una secuencia problema vírico
de interés especifica.
Su
interpretaci Esto debido a la
ón de datos función de esta para
es por mostrar los segmentos
medio de de DNA viral una vez
gel agarosa secuenciado
 Proceso

Como tal primero se obtiene la muestra de

mRNA, a la cual se le agrega RT y
Oligonucleótidos junto dNTP’s, para
obtener una cadena de DNA
complementaría a la de mRNA

Posterior a esto la cadena de RNA es

liberada y con ayuda de la DNA
polimerasa se formara otra cadena.
Esto permite obtener una
secuencia genética en forma
de una hebra de DNA, para
después continuar con el
proceso de la PCR.

En la cual por medio de 3

procesos uno de
desnaturalización, el
alineamiento y la extensión
de la región ampliada así
como sus clonas
 Interpretación

Esta se realiza en un gel de agarosa, a la cual se le

realiza un electroforesis, esta matriz solida funciona
como filtro en el cual separa molecular de acuerdo
a su tamaño.

Por ello mismo gracias a los Ác. nucleicos y grupos

fosfato , la carga negativa del genoma migra hacia
el polo positivo durante la electroforesis y por medio
de la tinción de bromuro de etidio y la luz UV se
observa el patrón de bandas del genoma Ampliación no especifica en gel agarosa. Recuperado
de: Koneman E.W y Allen S. (2008) Koneman
diagnostico microbiológico Texto y atlas a color.
Aplicaciones

 Análisis de muestras de infecciones virales

 Identificación de mecanismos inmunológicos,
cáncer, y translocaciones cromosómicas en
DNA
 Identificación molecular por muestras de
RNA.
PCR en tiempo real
 Fundamento

La amplificación y la detección en un mismo paso al

correlacionar el producto de la PCR de cada uno
de los ciclos con una señal de intensidad de
fluorescencia

Rapidez en la
Posee alta Amplio rango
visualización
especificidad de detección
del producto

No es necesario realizar una

electroforesis
posterior.
 Sistemas de
detección
Fluoróforos con afinidad por el ADN Sondas específicas
 Emiten fluorescencia cuando se
 Específicas para una
unen al ADN.
secuencia de interés se
 El compuesto más utilizado es SYBR
pueden dividir en tres tipos:
Green, mientras más ADN de doble
a) Sondas de hidrólisis
cadena haya en el tubo de
b) Sondas de hibridación
reacción, mayores serán la unión y
c) Sondas de horquilla
la señal de fluorescencia
Sondas de hidrólisis Sondas de hibridación Sondas de horquilla
 Metodología

El proceso en general es muy

parecido a la PCR convencional,
la mayor diferencia es que el
termociclador utilizado en este
proceso es diferente al usado en
la PCR normal ya que este tiene
la capacidad de hacer incidir
sobre la muestra un haz de luz a
cierta longitud de onda y
detectar la fluorescencia del
flurocromo.
Interpretación

Para poder interpretar los datos de la fluorescencia se realizan ciertos

softwares el cual genera 2 graficas la cual muestra los datos necesarios
para saber si la reacción fue exitosa. La grafica de amplificación muestra
el curso y el proceso de la reacción, mientras que la gráfica de
disociación muestra información sobre la especificad de la reacción.
 Aplicaciones
Campo de la salud
 En el diagnóstico de enfermedades, como cáncer, anomalías
genéticas o infecciones. El uso de este tipo de técnicas en el
diagnóstico de enfermedades provocadas por microrganismos,
además se usa como herramienta para la prevención de nuevas
enfermedades.

Usos en investigación
 Su uso es mayormente aplicado a las mediciones cuantitativas de la
transcripción y expresión génica, estas nos ayudan a determinar cómo
cambia la expresión de un gen de interés en el transcurso del tiempo o
bajo condiciones específicas. De igual forma se usa para determinar la
homocigosis o heterocigosis de un individuo para un determinado gen.
Producción de DNA complementario
 Fundamento

La función de la transcriptasa reversa es producir

una cadena complementaria de RNA pero como
DNA el cual será complementario a este y estable al
calor para poder realizar el proceso, para ello en el
proceso se une un primer a la secuencia de RNA
objetivo

Este proceso al menos en los procesos de PCR, se

utiliza por medio de la RT- en la cual el RNA objetivo
junto con un oligonucleótido y la RT producen una
copia de DNA en base al segmento de RNA
obtenido por la muestra, dado esto se puede
expandir por PCR y obtener más de una cadena de
cDNA.
Interpretación

Al igual que una PCR este se realiza por

la comparación de tamaños por
electroforesis por gel de agarosa en la
cual se pueden observar el tamaño de
las bandas obtenidas
 Bibliografía

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