Universidad de Los Andes

Facultad de Farmacia y Bioanálisis

Escuela de Bioanálisis
Departamento de Microbiología y Parasitología
Cátedra de Microbiología Aplicada – Farmacia

Endotoxinas Bacterianas.
Pirógenos
Prof.. Andrea Colls

Diciembre, 2016
 REVISION DEL TEMA
ANTERIOR
-Productos estériles
-pruebas de esterilidad
-Prueba en placa y tubo
-Periodo de incubación
-Interpretación de resultados
 Burdon Sanderson: designo como pirógeno a una
sustancia piretógena que obtuvo de la carne
putrefacta demostrando que procedía de bacterias
vivas.

Pirógenos

Seibert, en 1923, confirmo que todas las llamadas

fiebres de la inyección se debían a la presencia de
pirógeno en el agua destilada, de procedencia
bacteriana.
 Pirógenos

Son producto del metabolismo microbiano.

Se incluyen: virus, sustancias químicas,

endotoxinas y exotoxinas de bacterias gram
negativas.

Las bacterias gram positivas también producen

pirógenos pero de menor potencia y de
naturaleza químicamente diferente.
 • Son producidos por • Son ajenos a la

Pirógenos exógenos
Pirógenos endógenos

el huésped, persona, los más

generalmente en comunes son
respuesta a endotoxinas
estímulos bacterianas, por
provenientes de las ejemplo lipo-
infecciones o polisacáridos (LPS)
inflamaciones. que provienen de
(Citocinas e fragmentos de la
Interleucinas). membrana celular
de bacterias Gram.-
negativas.
 Comparación de las envolturas
celulares bacterianas

FUENTE: Generalidades de bacteria. Departamento de Agentes Biologicos. Prof. Victor

Cortez. Universidad de Buenos Aires. UBA. Argentina.
 Control de pirógenos

Los pirógenos son contaminantes en un producto

farmacéutico.
Pueden ingresar a un medicamento por cualquier
medio que introduzca microorganismos vivos o
muertos.

La presencia de pirógenos en productos

terminados es indicativa de un procesamiento
realizado bajo condiciones de limpieza mal
controladas.
Se recomienda realizar procesos de fabricación
con la mayor rapidez posible.
Síntomas de la reacción pirogénica en el
hombre

Bajas dosis de pirógenos inducen

reacciones inflamatorias, sin síntomas
clínicamente significativos.

Dosis moderadas de pirógenos inducen

fiebre y cambios significativos en la
composición del plasma.
Fuentes de Contaminación

(Preparación de productos
estériles, Lavado de material que
entra en contacto directo,
Almacenamiento)

Envases y
El Agua
Equipos

Materia
Prima

Procesos de
Fabricación
Eliminación de pirógenos
Despirogenización de vidrios: Calentamiento a
altas temperaturas, 250ºC x 45 min.; o 650ºC x 1
min.; o 180ºC x 4 h.

El ciclo normal de autoclave no destruye

pirógenos

La ósmosis inversa y resinas de intercambio

iónico eliminan pirógenos del agua.
Calentamiento con álcalis diluido, tomando las
precauciones de que se no se afectarán los
constituyentes del producto.

Destilación
 Método de Análisis in vivo
En un inicio, la presencia de pirógenos en agua y disoluciones
acuosas se probaba inyectando la solución problema a conejos
y esperando para observar si se presentaban signos de fiebre.

Condiciones de Animales de Prueba

-Macho o Hembra.
-Buena salud
-≥ 1.5 Kg. Ninguna pérdida de peso en la semana
anterior al ensayo.
-Alimentación: un régimen equilibrado exento de
antibióticos.
 Material de Ensayo
- Equipo de vidrio despirogenizado.
- Solución por inyectar a una temperatura de
37ºC±2ºC, protegida de toda contaminación.
- Volumen de la inyección: Según las monografías o
10mL/Kg.
- Tiempo de inyección: ≤ 10 minutos.
- Precisión de los Termometros:± 0,1ºC

Condiciones del Ambiente

Las salas de cuarentena, de estancia y de ensayos se
climatizan en las mismas condiciones de ambiente.
- Temperatura 18 ±2ºC
- Humedad Regulada 50 ± 10%
Prueba del Conejo
Se utilizan 3 conejos. 10 mL de la solución de
prueba/Kg. en una vena de la oreja, tiempo de
inyección 10min.

Se registra la temperatura rectal a 1, 2 y 3 horas

después de la inyección.

Se permite una elevación térmica de 0.6 ºC para

cualquier conejo y un total de 1.4ºC para los 3
conejos.

Si estos límites se sobrepasa, incluir otros 5 conejos. el

requisito establece que no más de 3 conejos pueden
mostrar una elevación de 0.6ºC y la elevación térmica
total para los 8 es de 3.7 ºC o menos.
Desventajas de este método
Cría de Animales.
Área especial para desarrollo
del método.

Estrés ocasionado a los animales.

Imprecisiones del método.

 LAL (Limulus Amebocyte Lysate)
Es un extracto acuoso obtenido del lisado de las células
sanguíneas (amebocitos) del cangrejo (herradura)
Limulus Polyphemus.

Si el lisado de estos amebocitos se enfrenta a una formulación

que contiene pirógenos, se producirá un coágulo, pudiendo ser
detectado y cuantificado.

Coraza de un Limulus polyphemus o

cangrejo herradura escaneada en
distintas posiciones para apreciar su
forma.
 Métodos de Ensayo de LAL
• Los métodos principales son:

Método de Coagulación o Gel – Clot

Método Turbidimétrico

Método Cromogénico.
 Método Gel - Clot

Es la prueba más simple y la más usada.

Es un método oficial, es decir, un método establecido

en la USP y otras farmacopeas.

Consiste en la mezcla de cantidades conocidas del

reactivo de LAL con la muestra, incubación a 37ºC en
baño de maría, durante una hora y posterior
comprobación de evidencia coágulo.
Preparación del material y Muestra para
el ensayo

• Sensibilidad del lisado.

• Que el material utilizado no adsorba endotoxinas.
• La ausencia de factores que interfieran con la
determinación.
Reactivos y Patrón de Referencia

Estándar de Endotoxina USP.

Lisado de Amebocitos Limulus. Reconstituir

el lisado de la forma especificada.

Agua para prueba de endotoxina bacteriana

PEB

Ácido Clorhídrico 0,1M e Hidróxido de Sodio

0,1M preparado con agua PEB.
Sensibilidad Específica
El reactivo de LAL está rotulado con una
sensibilidad específica determinada por el
fabricante.

La sensibilidad se expresa como Lambda

(λ).Siendo λ la sensibilidad a la cual el
reactivo LAL es capaz de coagular en
presencia de Endotoxinas Bacterianas.
La sensibilidad es la menor de una serie de
concentraciones de endotoxina que coagula
bajo condiciones específicas.

Detecta hasta 0.03 UE/mL.

Confirmación de la sensibilidad declarada
(λ) del reactivo
Ejemplo:
Sensibilidad declarada de LAL: 0.125 EU/mL
Hacer la prueba con 4 concentraciones estándar por cuadriplicado.
El punto final es la concentración más baja que forma coágulo.

Estándar 0.25 0.125 0.06 0.03 Control

EU/mL 2λ Λ 1/2λ 1/4λ negativo
+ + - - -
+ + - - -
+ + - - -
+ + - - -
 Ensayo Cuantitativo
-La concentración de endotoxina en la muestra se determina
ensayando una serie de diluciones de la misma.
-El punto final es la última dilución que da un resultado
positivo
-Para obtener la concentración de endotoxina en la muestra
se multiplica la sensibilidad declarada del reactivo por el
factor de dilución.

1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128

+ + + + + - - -
+ + + + + - - -

El punto final es la dilución 1:16. El factor de dilución es 16.

Concentración de Endotoxina = 16x0.125UE/mL = 2UE/mL en la muestra
original.
 Generalmente un ensayo positivo
indica la formación de un gel de
coágulo sólido.

Es necesario realizar controles positivos

y negativos en cada ensayo para de
esta forma excluir la posibilidad de
falsos positivos debido a contaminación
y de falsos negativos debido a la
inhibición de la reacción de coagulación
 Criterio de aceptación de la prueba

El producto cumple con los

requisitos de la prueba si la
concentración de endotoxina no
es mayor que la especificada en
la monografía respectiva.
 Pirógenos

Criterio de Síntomas
aceptación

Método in vitro Fuentes

Método in vivo Eliminación

Referencias Bibliográficas

Harrison. Principios de Medicina Interna. Mc

Graw Hill Interamericana

Albia Pozo. Pediatría y Medicina Interna. BVS.

Bueguet Nancy, Brito Lazaro. Validacion del

Método LAL para determinar endotoxinas
bacterianas en soluciones inyectables. FINLAY
Ediciones.
The United States Pharmacopeia USP 37.
Printed by National Publishing, Philadelfia, P.A.