HPLC:

TEORÍA DE ELUCIÓN POR GRADIENTE

DESARROLLO DE METODOS

Yhoan Sebastian Gaviria Gaviria

Universidad de Antioquia
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Facultad de ciencias farmacéuticas y alimentarias
LABORATORIO DE NUTRICIÓN Y TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS
 TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN
2. FORMA DEL GRADIENTE
3. CLASIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS
4. EFECTOS DE LAS CONDICIONES DE GRADIENTE EN LA SEPARACIÓN
5. DESARROLLO DE MÉTODOS
6. INTERPRETACIÓN INICIAL DE UN CROMATOGRAMA
7. DESARROLLO DE UN GRADIENTE
8. CONVERSIÓN DE ELUCIÓN EN GRADIENTE A ISOCRATICA
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 INTRODUCCIÓN

- ELUCIÓN ISOCRATICA: Mantiene las condiciones cromatográficas constantes durante

la separación.

La fuerza de elución se mantiene constante.

- ELUCIÓN EN GRADIENTE: Se refiere a un cambio continuo en la fase móvil durante la

separación.

La fase móvil se vuelve mas fuerte a medida que avanza la separación.

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 INTRODUCCIÓN

Mezcla de 9 herbicidas; ACN-agua; Columna C18 150x4,6 mm 5 um; 2.0 mL/min; T ambiente
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INTRODUCCIÓN

Mezcla de ácidos carboxílicos aromáticos.

Cromatografía de intercambio iónico.
a. 0.055 M NaNO3 in wáter
b. gradient from 0.01 to 0.10 M NaNO3 in
20 min.

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FORMA DEL GRADIENTE

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SIMILITUD ISOCRATICO GRADIENTE

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 CLASIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS
MUESTRA REGULAR MUESTRA IRREGULAR

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 CLASIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS

Columna C18 150x4,6 mm 5 um; 2.0 mL/min; a. MeOH-agua T ambiente b. ACN-buffer citrato 25mM T 32°C 9
EFECTOS DE LAS CONDICIONES DE GRADIENTE EN LA SEPARACIÓN
CAMBIOS EN EL TIEMPO DE GRADIENTE

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Columna C18 150x4,6 mm 5 um; 2.0 mL/min; ACN-buffer citrato 25mM T 32°C
EFECTOS DE LAS CONDICIONES DE GRADIENTE EN LA SEPARACIÓN
CAMBIOS DIMENCIONES DE LA COLUMNA

Columna C18 5 um; 2.0 mL/min; MeOH-agua T 30° c; 0 – 100 Gradiente 11

EFECTOS DE LAS CONDICIONES DE GRADIENTE EN LA SEPARACIÓN
CAMBIOS DIMENCIONES DE LA COLUMNA

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Columna C18 5 um; 2.0 mL/min; ACN-Buffer T 43° c; 5 – 100 Gradiente
EFECTOS DE LAS CONDICIONES DE GRADIENTE EN LA SEPARACIÓN
CAMBIOS EN FLUJO DE LA FASE MOVIL

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Columna C18 50 x 4,6 5 um; 2.0 mL/min; MeOH-agua T 30° c; 0 – 100 Gradiente
EFECTOS DE LAS CONDICIONES DE GRADIENTE EN LA SEPARACIÓN
CAMBIOS EN PORCENTAJE INICIAL DE FASE MOVIL

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Columna C18 50 x 4,6 5 um; 2.0 mL/min; MeOH-agua T 30° c
EFECTOS DE LAS CONDICIONES DE GRADIENTE EN LA SEPARACIÓN
CAMBIOS EN PORCENTAJE INICIAL DE FASE MOVIL

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Columna C18 50 x 4,6 5 um; 2.0 mL/min; ACN-Buffer T 42° c
EFECTOS DE LAS CONDICIONES DE GRADIENTE EN LA SEPARACIÓN
CAMBIOS EN PORCENTAJE FINAL DE FASE MOVIL

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Columna C18 50 x 4,6 5 um; 2.0 mL/min; MeOH-agua T 30° c
EFECTOS DE LAS CONDICIONES DE GRADIENTE EN LA SEPARACIÓN
EFECTO DE UN RETRASO EN EL GRADIENTE

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Columna C18 50 x 4,6 5 um; 2.0 mL/min; MeOH-agua T 30° c
EFECTOS DE LAS CONDICIONES DE GRADIENTE EN LA SEPARACIÓN
EFECTO DE UN RETRASO EN EL GRADIENTE

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Columna C18 50 x 4,6 5 um; 2.0 mL/min; ACN-Buffer T 42° c
EFECTOS DE LAS CONDICIONES DE GRADIENTE EN LA SEPARACIÓN
EFECTO DE LA FORMA DEL GRADIENTE

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Columna C18 250 x 4,6 5 um; 1.0 mL/min; THF-agua T 35° c
DESCRIPCIÓN GENERAL DEL EFECTO DE LAS CONDICIONES DE
GRADIENTE EN EL CROMATOGRAMA
- Tiempo de gradiente.
- Dimensiones de la columna.
- Flujo de la fase móvil.
- Rango del gradiente.
- Porcentaje inicial y final de la fase móvil.
- Retraso del gradiente.
- Forma del gradiente.
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 DESARROLLO DE METODOS

- Objetivo separación.
- Naturaleza de la muestra.
- Condiciones experimentales para la primera corrida.
- Repetibilidad de los resultados.
- Disponibilidad de software de simulación.
- Posible necesidad de un pre-tratamiento.

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 DESARROLLO DE METODOS
OBJETIVO DE LA SEPARACIÓN

- Evaluación preliminar de la muestra.

- Desarrollo de un procedimiento de rutina.

- Desarrollo de una separación genérica o de huella digital.

- Desarrollo de una separación preparativa.

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 DESARROLLO DE METODOS
NATURALEZA DE LA MUESTRA

- Peso molecular.

- Presencia de ácidos o bases. (pKa).

- Presencia de isómeros o enantiómero.

- Presencia de compuestos muy polares

- Presencia de compuestos hidrófobos.

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 DESARROLLO DE METODOS
CODICIONES EXPERIMENTALES INCIALES

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 DESARROLLO DE METODOS
INTERPRETACIÓN DEL CROMATOGRAMA INICIAL

¿La elución por gradiente se

requiere para la muestra?

Columna C18 150 x 4,6 mm 5 um; 2.0 mL/min; ACN-Agua T 32°C 25

DESARROLLO DE METODOS
RESOLUCIÓN VS CONDICIONES

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 DESARROLLO DE METODOS
OPTIMIZACIÓN DEL GRADIENTE DE RETENCIÓN K*

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Columna C18 150 x 4,6 mm 5 um; 2.0 mL/min; ACN-Buffer; 5-100
DESARROLLO DE METODOS

OPTIMIZACIÓN DEL GRADIENTE DE

SELECTIVIDAD α*

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 DESARROLLO DE METODOS
OPTIMIZACIÓN DEL GRADIENTE DE SELECTIVIDAD α*

Columna C18 150 x 4,6 mm 5 um; 2.0 mL/min; ACN-Buffer; 5-100

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 DESARROLLO DE METODOS
OPTIMIZACIÓN DEL RANGO DE GRADIENTE

Columna C18 150 x 4,6 mm 5 um; 2.0 mL/min; ACN-Buffer; pH 2,6 30

 DESARROLLO DE METODOS
OPTIMIZACIÓN DEL NUMERO DE PLATOS N*

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Columna C18 150 x 4,6 mm 5 um; 2.0 mL/min; ACN-Buffer; pH 2,6
CONVERSIÓN DE ELUCIÓN EN GRADIENTE A ISOCRATICA

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REFERENCIAS

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Gracias por su atención.

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