Cromatografía Líquida

Asociada a MS/MS

Nancy Torres S.
Especialista en Cromatografía
ntorres@genesyschile.cl
 Introducción
XIC of +MRM (34 pairs): 253.2/171.2 amu from Sample 14 (1ng/ml QqQ in soil) of c... Max. 6620.0 cps.

6.9
6500

6000

5500

5000

4500
In te n s ity , c p s

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Time, min

La cromatografía es la ciencia y el arte de separar entre sí

los compuestos de una sustancia
 ¿Qué es un HPLC?

High Performance Liquid Chromatography

 Es una técnica de separación en la cual la muestra se

disuelve en un líquido y se hace pasar a través de una
columna rellena con partículas de tamaño muy pequeño.
El proceso permite la separación de la muestra en sus
diferentes componentes
 Es la más importante y utilizada para en el análisis de
compuestos orgánicos y biomoléculas
 Amplia gama de aplicaciones
– Muy utilizada en la industria farmacéutica, cosmética,
alimenticia y bioquímica.
 Historia

• La Cromatografía fue descubierta por el botánico

ruso Mikhail Tswett quien separó pigmentos de
plantas en columnas de silica gel en 1903.
• Los Químicos Británicos P. Martin y M. Synge
desarrollaron la división de Cromatografía en 1942;
y en 1952 Martin y T. James, desarrollaron la
Cromatografía de Gases (CG).
• Desde la década de los 40, se utilizaron columnas de
sílica para purificar materiales orgánicos, con elusión
por gravedad.
CL Clásica
(Flujo por Gravedad)
 Muestra: mezcla de sustancias que
contiene la matriz, y los analitos de
interés.

Matriz: se dice que es inherente y

característica a lo que se este
analizando, ej: Pera, Salmón, cerdo etc.

Fase estacionaria: Es aquella que

compone un medio de separación,
que interactúa en forma selectiva
con el analito.

Fase móvil : Es aquella que fluye

a través de la columna, transportando la
muestra con los analitos (Líquido) .
• La Cromatografía es una herramienta de la química
analítica.

• Para analizar un compuesto debemos preocuparnos de

eliminar por un proceso de extracción los compuestos que
provoquen interferencias en el análisis.(Supresión Iónica)

– Luego hay que analizar los componentes para hacer

una identificación de estos, utilizando bibliotecas si se
dispone de ellas o contra un estándar.

– Saber la concentración de dichos componentes.

– Para que exista cromatografía debe haber: Analitos,

fase estacionaria y fase móvil (Líquido).
 Componentes de la Cromatografía
xoxo
xoxo

Muestra: Motivo a elucidar o Fase

analizar. Móvil

Fase móvil : Es aquella que fluye

a través de la columna, transportando la
muestra con los analitos (Líquido) . Fase
Estacionaria

Fase estacionaria: Es aquella que

compone un medio de separación,
que interactúa en forma selectiva
con el analito.
 Interacciones en la Fase estacionaria

Los componentes son Fase móvil

colocados (aplicados) al
inicio del sistema de oxoxo
xoxox
separación (INYECTOR).
Fase móvil
A medida que éstos son arrastrados
oooxxx
por la fase móvil (líquido), se comienzan a
oooxxx
distribuir, separándose por diferencias
de afinidad con la fase estacionaria.
Fase móvil
ooo xxx
ooo xxx
Finalmente los componentes salen
separados para posteriormente ser
detectados.
 Clasificación de las técnicas cromatográficas

• Fase Normal o Líquido-sólido (NP, LSC)

– Separación basada en absorción /desorción del analito sobre una
superficie polar (sílica o fases con enlaces polares).
• Fase reversa (RPC)
– Separación basada en el equilibrio de coeficientes de partición del
analito, entre la fase móvil y la fase estacionaria.
• Intercambio iónico (IEC)
– Separación basada en intercambios iónicos con contra-iones e
interacción iónica del analito frente a los grupos constituyentes de la
fase estacionaria.
• Exclusión por tamaño (SEC - GPC or GFC)
– Separación basada en interacción de moléculas con diverso tamaño o
volumen, frente a una fase estacionaria usada como tamiz.
– Permeación en gel (GPC, orgánico) o Filtración por gel (GFC, acuoso)
Ref. L. R. Snyder and J.J. Kirkland, Introduction to Modern Liquid Chromatography, John Wiley & Son, New York, 1979.
 Fase Normal o Líquido-Sólido Cromatografía
(LCS)
Momento dipolar mayor que los enlaces
 Utiliza fases estacionarias polares de las moléculas del disolvente
como sílica, alumina, amino-, ciano o
grupos fenilo químicamente enlazados Flujo
– Fase móvil no-polar como hexano,
CH2Cl2 con propanol
– Los analitos polares presentan
tiempos de retención largos
– Con disolventes mas polares los
solutos se mueven más
rápidamente. (competencia)

 Excelente técnica para analitos no-

polares, isómeros, separaciones de
grupos y procedimientos de limpieza
de muestras
 •Cromatografía Normal
Adsorción

Se llama adsorción al fenómeno de acumulación de partículas sobre una

superficie. La sustancia que se adsorbe es el adsorbato y el material sobre el
cual lo hace es el adsorbente. El proceso inverso de la adsorción es la desorción.
Las características principales de la adsorción son:

1º.- La adsorción es altamente selectiva. La cantidad adsorbida depende en gran

medida de la naturaleza y del tratamiento previo al que se haya sometido a la
superficie del adsorbente, así como de la naturaleza de la sustancia adsorbida.
Al aumentar la superficie de adsorbente y la concentración de adsorbato,
aumenta la cantidad adsorbida.

2º.- Es un proceso rápido cuya velocidad aumenta cuando aumenta la

temperatura, pero desciende cuando aumenta la cantidad adsorbida.

4º.- Dado que los procesos de adsorción son generalmente exotérmicos, al

aumentar la temperatura disminuye la cantidad adsorbida.
 Fuerza del disolvente: Series eluotrópicas
Disolvente e0 Disolvente e0
Acetato de etilo 0,58 Pentano 0,00
Acetona 0,56 Éter de petroleo 0,01
Acetonitrilo 0,65 Hexano 0,01
Ácido acético 1,00 Cicloxano 0,04
Agua Superior Tetracloruro de carbono 0,18
Benceno 0,32 Xileno 0,26
Cicloxano 0,04 Tolueno 0,29
Clorobenceno 0,30 Clorobenceno 0,30
Cloroformo 0,40 Benceno 0,32
Cloruro de Metileno 0,42 Eter etílico 0,38
Dicloruro de etileno 0,49 Cloroformo 0,40
Dimetilsulfóxido 0,62 Cloruro de Metileno 0,42
Dioxano 0,56 Tetrahidrofurano 0,45
Éter etílico 0,38 Dicloruro de etileno 0,49
Éter de petroleo 0,01 Metil etil cetona 0,51
Hexano 0,01 Acetona 0,56
iso-propanol 0,82 Dioxano 0,56
Metanol 0,95 Acetato de etilo 0,58
Metil etil cetona 0,51 Dimetilsulfóxido 0,62
Pentano 0,00 Acetonitrilo 0,65
Piridina 0,71 Piridina 0,71
n-Propanol 0,82 Iso-propanol 0,82
Tetracloruro de carbono 0,18 n-Propanol 0,82
Tetrahidrofurano 0,45 Metanol 0,95
Tolueno 0,29 Ácido acético 1,00
Xileno 0,26 Agua Superior
e0 Energía de adsorción de la fase móvil por unidad de área de la superficie adsorvente del patrón.
 Grupos representativos de la fase ligada
usados para la separación.
Acido iminodiacético - Ni 2+ Proteínas, polipeptidos
Nitrilotriacetato- Cu2+ Proteínas, polipeptidos

Ciclodextrinas (Oligo-D-Glucopiranosa) Separaciones de racematos

Sero Albúmuna Bovina (una Proteina) Separaciones Quirales
Aminoácidos (Cu 2+ en la fase móvil) Separaciones Quirales
Ferrocenilpropil amina Separaciones Quirales
 Cromatografía de Fase Reversa (RPC)
FLUJO
 Separación basada en la partición de un no polar
analito dentro de una fase estacionaria
hidrofóbica, químicamente enlazada sobre un
soporte de sílica, poliestireno y

Flujo
divinilbenceno(ej: C18, C8)
– Usa una fase móvil polar como por
ejemplo un mezcla metanol / acetonitrilo.
Los analitos polares eluyen primero
mientras los no-polares son más retenidos polar
por la fase estacionaria
 Modo cromatográfico más ampliamente
utilizado (>60% de las aplicaciones)
– Para analitos polares (solubles en agua),
medianamente polares y algunos cuantos
no-polares
– Los analitos iónicos se pueden separar
utilizando reactivos de par-iónico
 Señales cromatográficas

1. Uracil
2. Phenol
3. Acetophenone
4. Nitrobenzene
5. Methyl benzoate
Methyl 6. Toluene

Octyl (C8)
Octadecil (C18)

minutos minutos minutos

Efecto en el largo de la cadena de carbonos en columna fase reversa con partículas de 5µ. Con fase móvil de
50/50 MeOH /Agua, a un flujo de 1 ml/min
 1. Acido Sulfanílico
2. Sulfamerazina
3. Sulfisoxazole
4. Sulfapiridixina

Fig. cortecia de Phenomenex

A valores de pH 1,25 y 3,0 el sulfisoxazol es inestable y no eluye

Columna Phenomenex Luna 5µm C18, 150mm X 4,6mm, fase móvil 20 mM KH2PO4: Acetonitrilo 95:5
con el pH indicado, velocidad de flujo 1,0 ml/min
 1. Acido Sulfanílico
2. Sulfamerazina
3. Sulfisoxazole
4. Sulfapiridixina

Fig. cortecia de Phenomenex

A valores de pH entre 5,0 y 7,0 se produce un cambio en el orden de elución

Columna Phenomenex Luna 5µm C18, 150mm X 4,6mm, fase móvil 20 mM KH2PO4: Acetonitrilo 95:5
con el pH indicado, velocidad de flujo 1,0 ml/min
 1. Acido Sulfanílico
2. Sulfamerazina
3. Sulfisoxazole
4. Sulfapiridixina

Fig. cortecia de Phenomenex

La separación es excelente a valores de pH de 9,0, siendo peor cuando el pH es 10

Columna Phenomenex Luna 5µm C18, 150mm X 4,6mm, fase móvil 20 mM KH2PO4: Acetonitrilo 95:5
con el pH indicado, velocidad de flujo 1,0 ml/min
 % de Metanol

La muestra es un preparado analgésico. Cada registro es isocrático al porcentaje de metanol indicado.

El metanol es un eluyente mas fuerte que el agua.
Condiciones experimentales: Columna ODS 0.26 x 25 cm. Eluyente metanol (% mostrado):agua + 0,5 %
H3PO4 a 1 ml/min
Efecto de Fittings

1. Largo
 Exclusión por Tamaño (SEC o GPC)
 Separación basada en la acción de un
colador de poliestireno con tamaño
FLUJO
de poro controlado
– Las fases móviles comunes son
tolueno, THF, CH2Cl2
– Las moléculas grandes eluyen
Gel
primero, mientras las moléculas
pequeñas penetran dentro de los
poros y eluyen después
Poro
 Ampliamente utilizada en la
determinación de Pesos Moleculares
de polímeros, biomoléculas y en
procedimientos de limpieza
 Efecto temperatura

• La viscosidad del disolvente disminuye (fluye más

fácilmente)
• Velocidades de difusión del soluto aumentan,
originando difusión más rápida en todas direcciones
• El equilibrio entre los diversos solutos y la fase
estacionaria se desplaza en proporciones diferentes.
• Las velocidades de los equilibrios de intercambio son
generalmente más rápidas.

• Todas la variaciones de equilibrio y los procesos de

transporte cambian con la temperatura
 Efecto de la Temperatura

20ºC 30ºC 20ºC 30ºC 20ºC 30ºC

Mezcla 1 Mezcla 2 Mezcla 3

 Efecto presión
•Se requiere mayor Presión para conservar la misma velocidad
de flujo que en una columna de mayor tamaño de partícula.

•El tamaño de la columna se reduce, acortando el tiempo de

Análisis.

•Si se reduce el diámetro se reducirá la cantidad de disolvente

utilizado
 Al disminuir la
longitud de la columna
disminuye la presión del
sistema.
1943 psi

4567 psi
 La Fase Móvil

Es el medio que permite conducir los analitos a través de la

columna, interactuando con ellos en el proceso de separación
cromatográfica.

Según el tipo de cromatografía es la naturaleza de la fase

móvil, por ejemplo:
 Presión y tamaño de partícula
500 psi 10µm

1500 psi
5µm 3µm
2560 psi
 Fase Móvil
Las fases móviles HPLC son usualmente una mezcla de uno o
más solventes con las siguientes características:
• Propiedades Físicas Deseables
– Alta pureza, bajo costo, no corrosivo, baja viscosidad, baja toxicidad,
no inflamable, solubilidad de la muestra
• Resistencia
– La resistencia está relacionada con la polaridad del solvente; agua es
un solvente fuerte en una fase normal pero débil en una fase reversa
– La resistencia de solventes en una fase normal está caracterizada
por la escala de Hildebrand (Eo)
• Selectividad
– Depende del momento dipolar, dipolo inducido enlaces de hidrógeno
y características dispersivas de los solventes

Los solventes serán filtrados y desgacificarse antes de ser utilizados

 Modificadores Comunes de la Fase Móvil, LC
Tradicional
• Buffers
– Estabiliza el pH de la Fase Móvil en RPC o IEC
(Fosfato, acetato, citrato)
• Acidificadores
– Para suprimir la ionización de analitos acidificados en RPC
(ácido fosfórico, ácido acético)
• Resistencia Iónica
– Para controlar la elusión de analitos iónicos en IEC (i.e.,
NaCl)
• Reactivos de par iónico
– Para la separación de compuestos iónicos en RPC (hexano
sulfonato de sodio)
• Modificadores Amino
– Para reducir la asimetría de analitos básicos en RPC
(trietilamina)
Componentes comúnmente utilizados en fase móvil
para LC MS:

•Buffer volátiles tal como Formiato de Amonio o Acetato de

Amonio
2-10mM es la concentración optima sobre 20mM puede
producir supresión.

•Acidos:
Ácido Acético a 0,1 -1%
Ácido fórmico a 0,1%
Ácido trifluoroacético, sobre 0,1% puede producir
supresión
( no utilizar en modo negativo)
Elución isocrática: composición constante de la fase móvil
Elución por gradiente: los distintos analitos son eluidos con incremento de la
composición de la fase móvil en la fase orgánica
 Gradientes
Analito (fase móvil) Analito (fase estacionaria)
Los cambios en el disolvente normalmente desplazan el equilibrio, y,
como resultado la separación se puede mejorar pasando de elución
isocrática a elución en gradiente.
Pendiente de la gradiente
 Filtrado y desgasificado de los solventes

• Filtrado
– Filtrar todos los solventes orgánicos o solventes acuosos a
través de membranas de 0.45-m (nylon, teflon, celulosa
acetato).
– Todas las bombas para HPLC deben tener un filtro en línea
de mínimo 1.0 m (normalmente se usa 0.45 m ).
• Desgasificado
– Desgasificar la fase móvil es importante para la exactitud
del mezclado de solventes de la bomba y para evitar la
formación de burbujas en la celda de flujo del detector.
– Las mejores maneras de desgasificar son burbujeando
Helio en los reservorios o utlilizando un sistema de
desgasificación en línea.
 El Sistema
Cromatográfico
 Componentes de un HPLC, generalidades
Componentes fundamentales de un cromatógrafo líquido
Reservorios para
Inyector Fases Moviles

Precolumna

Bomba HPLC

Columna Analítica

Sistema de Manejo
Detector
de Datos
Filtro en linea
 Sistemas de inyección
Manual

Se llama inserción manual cuando utilizamos cualquiera de las

clásicas válvulas para HPLC. Estas tienen un Loop de volumen fijo e
intercambiable. El Loop se debe utilizar en su completa capacidad y
debe ser llenado por medio de una jeringa apropiada (Sin punta y de
diámetro controlado).
 Tipos de inyectores manuales
Normalmente son de marca “Rehodyne”, ya que esta es la empresa
que tiene la mayor parte del mercado.
1- Inyectores manuales simples:
• Carga frontal de muestra
• Permiten cambio de “loop”
• No dan partida al sistema de adquisición de datos.
2- Inyectores manuales con partida electrónica:
• Carga frontal de muestra
• Permiten cambio de “loop”
• Dan partida automática al sistema de adquisición de datos, al momento de girar
el inyector.
3- Inyectores manuales inertes (Biocompatibles):
• Carga frontal de muestra
• Permiten cambio de “loop”
• Dan partida automática al sistema de adquisición de datos, al momento de girar el
inyector.
• Están construidos con materiales cerámicos o poliméricos, haciéndolos menos
reactivos que los convencionales.
 Inyectores Automáticos
2-Automuestreador

Este mecanismo permite automatizar la inyección. Normalmente

aceptan variados volúmenes de muestra, ya que cuentan con Loop
de alta capacidad (hasta 2000 ul). En estos instrumentos la
muestra se deposita en un vial especial y el sistema toma de manera
autónoma el volumen seleccionado previamente.

Volumen de inyección: 0.1-2000 µL

RSD: < 0.5% (3-100 µL)
Linealidad: 2-100 µL (r2 > 0.999)
Carryover: < 0.02%
 Bombas HPLC: Requerimientos
• Alta precisión (<1%) y libre de pulsos
– Velocidades de flujo entre 0.05 mL - 5 mL/min para columnas
analíticas , 0.01 - 0.2 mL/min para nano y hasta 10 mL/min para
columnas semi-preparativas
– Que permita alta presiones de operación (hasta 5000 psi y más)
• Compatible con la mayoría de los eluyentes
– Solventes orgánicos, buffers y sales
– Construida con materiales inertes como acero inoxidable, PEEK,
teflon, titanio, rubí, safiro etc.
• Confiable operación con larga vida útil de los sellos
– Fácil mantenimiento y servicio
• Para bombas que permitan gradiente
– Las bombas para 2 o 4 solventes deben tener buena exactitud en la
composición y precisión en la programación de gradientes
Bomba de Pistón Simple
Desarrollando un método
cromatográfico
 Tipos de Columnas

Micro HPLC. 0,1 ml a 5 ml de flujo, max. presión 5800 psi

columna 3µm x 50mm x 2,1mm

Nano HPLC: 20 nl a 1 ul de flujo, max. presión 5800 psi columna,

3,5µm x 30mm x 75µm.

UPLC: 0,1 ml a 5ml de flujo, max. presión de 15.000 PSI ,

columna 1,7µm x 5µm x 1mm
 Elección de la mejor columna

Esta decisión es dependiente de varios factores, en donde

normalmente priman dos, costo y aplicación.

Es crucial asegurar la afinidad polar y compatibilidad de la

columna para con todas las series de analitos a trabajar.

Debido a que muchas veces existen grandes diferencias de

polaridad y afinidad en los componentes de una muestra compleja, no
existe la columna perfecta.

Es por esto que se hace necesario escoger una que permita

la mejor elusión al máximo de analitos, considerando los rangos
extremos de temperatura, presión y resistencia a los solventes.
 Pasos en la selección de columnas
1. Seleccionar el modo cromatográfico
2. Fase de soporte
– Tipo, tamaño de particula, shape, tamaño de poro
3. Fase de separación (Sorbente)
– Tipo, Propiedad química (monomerica o polimerica),
end-capping
4. Configuración de Columna - largo, diámetro
5. Otras consideraciones
– Reproducibilidad entre grupos de muestras
– Actividad silanica

– Vida útil de la columna y pre-columna

 Grupos de enlaces comunes
Fase reversa
C18 Octadecyl
Si- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2-CH2- CH2- CH2- CH2- CH2-
CH2- CH2- CH2- CH3

C8 Octyl Si- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH3
C4 Butyl Si- CH2- CH2- CH2- CH3

Fase Normal
Si Silica S i - OH
CN Cyanopropyl Si- CH2- CH2- CH2- CN

Intercambio Iónico
SP Sulfo propyl Si - CH2- CH2- CH2- SO3-
CM Carboxymethyl Si-CH2-CO2-

DEAE Diethylaminoethyl Si - CH2-CH2-NH+ (C2H5)2

SAX Triethylaminopropyl Si-CH2-CH2-CH-N+(C2H5)3
 Guía para seleccionar la fase de separación
• C18
– La fase mas común, presenta buena retención y estabilidad
– La fase C18 dependiendo del fabricante puede tener diferente retención y
desempeño
• C8
– Es preferida por tener mejor compatibilidad con fases móviles con alto
contenido acuoso
• C4
– A menudo es usada para separación de proteínas (C18 para Péptidos)
• CN
– En ambos modos NP o RP; es usada en variadas aplicaciones (e.g.,
antidepresivos)
• Phenyl
– Para separaciones en RP aplicada a componentes de polaridad media;
selectiva para aromáticos
• Amino
– Es usada en reemplazo para el modo NP ; análisis de azucares.

Column Selection Guides, PE Brownlee HPLC Column Catalog, Perkin-Elmer, L-1928, Norwalk, CT, p.27
Mantenimiento
Revisión rutinaria en cromatografía Líquida
EL ANALISTA DEBE CONTROLAR :
1- Solventes y fases pre-mezcladas
2- Funcionamiento normal de ventiladores y filtros

3- Estado de filtros en línea y filtro de reservorio

4- Mantención de Bomba y filtraciones

5- Condición de suciedad en el cromatógrafo

(incluye estado de columna y Fuente de inyección

6- Condición de accesorios, jeringas e inyector

 Mantenimiento del cromatografo
Limpieza de columna
Frecuencia: Luego de cada set de muestras.

Cambio de sellos en válvula de inyección

Frecuencia: Según número de inyecciones.

Limpieza filtros para fases móviles

frecuencia: Según número y carga de las inyecciones
(Semanal).

Cambio de sellos en bomba

Frecuencia: Según tiempo de trabajo.

Cambio de Conectores
Evaluando el performance
cromatográfico
 Análisis Cualitativo

El análisis cualitativo por cromatografía es

bastante simple , una vez que los componentes son
separados , es fijado el flujo, composición de la fase
móvil y la temperatura de trabajo. Entonces, para estas
condiciones, el tiempo de retención se hace característico
al compuesto. Por lo tanto solo es necesario reproducir
estas condiciones para dar un resultado cualitativo al
análisis.
 Análisis Cuantitativo

Existen diferentes tipos de cálculos , pero el principio

básico es que el área bajo la curva del peak es
directamente proporcional a la concentración del
compuesto en la muestra.

Por ser esta una medida relativa, se debe tener en

cuenta que este análisis es válido
en las condiciones establecidas para una cromatografía en
particular y empleando un estándar apropiado en cuanto
a concentración e integridad.
 Eficiencia Cromatográfica
Factores asociados a la Eficiencia Operacional

Mínimo tiempo de análisis:

– Dependiente del típo de Columnas
– Dependiente del largo de Columna
– Dependiente del diámetro y tamaño de partícula

Mínimo instrumental:
•Acondicionamiento y estabilización
•Mantención y limpieza del instrumento
 Factores asociados a Eficiencia, Resolución y vida útil de las
columnas

• La vida útil típica esta entre 3 - 12 meses o 100 - 1,000 inyecciones (Según
estudios realizados desde 1994)
• La vida útil de una columna esta determinada por:
– Materiales de elaboración, estabilidad de la fase de relleno, procedimiento de
empacado y calida de los reactivos utilizados entre otros.

• Las causas mas comunes para que una columna sea dada de baja son:
– Tapones
– División de picos
– Tailing
– Pérdida de eficiencia y retención

• La vida útil de una columna es maximizada cuando:

– Se le da un buen cuidado y mantención
– Se realiza regeneración
– Al usarla juiciosamente y con pre-columnas (Guarda Columnas)
 Conclusiones de la teoría cromatográfica

La Cromatografía es una técnica de la química

analítica que nos permite a través del uso de estándares,
identificar y cuantificar mezclas de iones y moléculas, que
cumplan con las condiciones básicas que permita el
análisis por esta técnica.

Aunque la teoría de la cromatografía es muy clara, la

práctica en esta técnica, es esencial para poder lograr la
confianza en los datos entregados por el instrumento.
 Parámetros de control de calidad cromatográfico

- Tiempo de retención

- Factor de capacidad

- Factor de separación o especificidad

- Factor de Resolución

- Rendimiento de la columna

- Factor de cola
 Tiempo de Retención (tR)
tR = Tiempo de Retención t0 = Tiempo de Retención de
un soluto sin retener o
tiempo de volúmen muerto
Wb = Ancho de la base de pico .

tr

Inyección

Tiempo
El pico tiende a ser “ gaussiano” y “ensancharse” con el tiempo - Wb comienza a ser mas grande
con un tR.corto
 Volumen de Apoyo (T0)
Es el volumen de fase que eluye de la columna desde que se
inyecta la muestra hasta que se alcanza la cima del primer pico
eluido.

• El detector no es sensible a la materia asociada a esa banda y,

por tanto, no responde o, ninguno eluye con el volumen de
apoyo
• Todos los componentes de la muestra interaccionan con la fase
estacionaria y, por tanto, ninguno eluye con el volumen de
apoyo.

Volumen corregido de elución o volumen corregido de retención

Volumen neto de elución(TR’)=To - TR
 Resolución (Rs)
• Rs (resolución) = (tR1 - tR2 ) /(Wb+ Wb)= t / 1/2Wb = 23 / 14 =1.5
2
• Rs es una medida del grado de separación de dos picos
• Rs = 0 (sin separación); Rs = 1 (separación parcial);
Rs = 1.5 (separación de la línea base)

Rs = 1.5

Inyección

Resolución obtenida, se determina por la elección de la fase estacionaria,

la fase móvil, la temperatura y la longitud de la fase estacionaria.
 Rendimiento de la Columna
• Número de platos teóricos (n) es la medida del rendimiento de
la Columna
• n = (tR /) 2 = 16 (tR / Wb ) 2 = 16 (135 / 10)2 = 2916
• n es determinado por el tamaño de la partícula (dp ), largo de la
columna (L) y flujo estimado (F)
tR

Inyección

Wb es el ancho del pico en la base medida por las tangentes. Altenativamente, se utiliza= 5.54 (tR / W0.5 ) 2
 Asimetría
Simétrica As = 1
Colas As > 1 
As= 
Frentes As < 1 
 Asimetría

• Disminuir la sobrecarga, reducir la muestra y aumentar el área

de la superficie disponible.
Evaluación de sobrecarga para la columna
 Buenas practicas
analítico-cromatográfico
 Tipos de metodologías de análisis.
- Análisis Cuantitativo por Estandarización

• Se llama análisis por Estándar interno

• Se llama análisis por Estándar externo
(IST),cuando ase agrega a los
cuando antes de ingresar la muestra, se
estándares y muestras una concentración
inyecta los componentes a analizar en
conocida de un componente que no esta
diferente concentraciones conocidas (
presente en ninguna de las anteriores,
estándares ), los que posteriormente
esto con el fin de minimizar con certeza
permitirán evaluar por comparación directa
la variación en la respuesta, producto de
los componentes buscados en la muestra,
las diferencias de inyección, extracción y
ya sea por AREA o ALTURA. Esto lo
degradación entre otros. Esto se realiza
denominamos hacer curvas de calibración.
por medio de la relativización de las
áreas estándares frente a las del
Estándar Interno, Construyendo curvas
de calibración en donde el eje de la “X”
grafica “Concentración del ST” y el eje
“Y”, “Área de St / Área IST”
Curva de calibración por Estándar Externo
S4

Abs = k*c +b S3

S2
Respuesta

S1
Muestra desconocida

k
b
Concentración
 Curva de calibración por Fortificación
S4

Abs = k*c +b S3

S2
Respuesta

S1
Muestra desconocida

k
b
Concentración
Curva de calibración por Estándar Interno
S4
“Area ST / Area IST ”

Abs = k*c +b S3

S2
R

S1
Muestra desconocida

k
b
Concentración
 Adición de Estándar
S4 +M

0 = k*c +b S3 +M

S2 +M
Respuesta

S1+M

Concentración de Concentración
Muestra desconocida
 Cuantificación con un nivel de calibración

Según documento Nro. SANCO/2007/3131

Puede Producir resultados más exactos, siempre y cuando el
rango de concentración del punto de calibración sea cercano al
que se desea determinar.
 Cuantificación con un nivel de calibración

Según documento Nro. SANCO/2007/3131

Puede Producir resultados más exactos, siempre y cuando el

rango de concentración del punto de calibración sea cercano al
que se desea determinar
1.65 x 50%
Alcances prácticos
de la metodología
 Comenzando a trabajar
 Filtrar los solventes

 Desgasificar los solventes (sin

desgasificación en línea)

 Purgar la bomba
Jeringa
de purga
Puerta
 Acondicionar el sistema de acceso
 Filtrado y desgasificado de los solventes
• Filtrado
– Filtrar todos los solventes orgánicos o solventes acuosos a
través de membranas de 0.5-m (nylon, teflon, celulosa
acetato).
– Todas las bombas para HPLC deben tener un filtro en línea
de mínimo 1.0 m (normalmente se usa 0.5 m ).
• Desgasificado
– Desgasificar la fase móvil es importante para la exactitud
del mezclado de solventes de la bomba y para evitar la
formación de burbujas en la celda de flujo del detector.
– Las mejores maneras de desgasificar son burbujeando
Helio en los reservorios o utilizando un sistema de
desgasificación en línea.
 Sistema de una Columna

• Tipo - estándar o de cartucho

• Materiales - acero inoxidable , PEEK, vidrio, titanio
• Conectores finales y filtros (0.5 µm )
• Conectores (tuercas y ferrulas)
• Tubos de conexión (1/16” o.d. and < 0.007” i.d.)
 Tubos de acople y conectores

• Conectores comunes (SS-316, titanium, plastics)

– Tuercas de compresión y férrulas de 1/16”
• Fabricantes: Rheodyne, Swagelok, Parker, Valco, SSI
• Férrulas estandar, ángulo del cono 45o, y 3 mm de
inserción
• Terminales plásticos ajustables con la mano
• Tubos de conección (SS 316, PEEK)
– 1/16” o.d. y < 0.007” i.d.
– De 0.005” i.d. para aplicaciones con columnas pequeñas y
flujos bajos y 0.010”-0.020” i.d. para aplicaciones preparativas
– Tubería PEEK flexible y facil de usar
– (PEEK = polyetheretherketone)
Tubos de acople y ferrulas
 Referencias

1. Validated Columns, PE Brownlee Data Sheets, L-1918, L-1930,

Perkin-Elmer, Norwalk, CT, 1996.

2. Fast LC, PE Brownlee Technical bulletin, L-1950, Perkin-Elmer,

Norwalk, CT, 1996.

3. PE Brownlee HPLC Column Catalog, Perkin-Elmer, L-1928,

Norwalk, CT, 1996.

4. Análisis Instrumental kenneth A. Rubinson; Judith F. Rubinson

2001.

5. http://www.waters.com