ADN RECOMBINANTE

CARACTERÍSTICAS DE LAS ENZIMAS DE

RESTRICCIÓN
• -Cortan al DNA en sitios específicos de reconocimieto.
• -Endonucleasas aisladas de bacterias..
• -Reconocen secuencias de nucleótidos cortos (4-8 pb.).
• -Generalmente reconocen secuencias palindrómicas:
• 5’…GAATTC…3’
• 3’….CTTAAG….5’
• -Rompen el enlace fosfodiester: 5’-3’fosforilo-hidroxilo.
• -Generan extremos cohesivos y romos.
• -Frecuencia de cortes de enzimas de restricción.
• .sitios de 4 bases cortará fragmentos de ADN cada 256 bases (44).
• .sitios de 6 bases cortará fragmentos de ADN cada 4096 bases(64).
• -sitios de 8 bases cortará fragmentos de ADN cada 65536 bases(84).
CLASES DE ENZIMAS
CLONACIÓN
ETAPAS PARA LA CLONACIÓN DE ADN
 HIBRIDACIÓN
• CONCEPTO:
• Es el proceso de apareamiento de bases entre
monocadenas de polinuclíotidos complementarios
provenientes de fuentes distintas.

• USOS:
• -Para identificar moléculas de DNA específicas.
• -Para identificar moléculas de RNA.
•
 TECNICAS DE HIBRIDACIÓN
• Empleando sondas:Southern blotting.
• Proceso:De una mezcla de DNA, se digiere con
enzimas de restricción, luego se separa
electroforeticamente en un gel de agarosa, se
disocia en sus cadenas individuales con
soluciones alcalinas luego las hebras individuales
se transfiere a una matriz de nitrocelulosa, a
continuación se añade una sonda molecular en
forma de oligonucleótico marcado de longuitudes
conocidas, los que reconocen el tamaña del DNA
HIBRIDADO.
 CONTINUACIÓN
• Empleando sondas: Northern blotting
• Proceso: Para analizar moléculas de RNA se
digiere con enzimas específicas, luego se separan
electroforeticamente mezclas de mRNA de
extractos de células tejidos u órganos, y se
tranfieren a una membrana de nitrocelulosa. Para
determinar un mRNA de interés, se suele utilizar
una sonda de DNA y asi de origina un híbrido
RNA-ADNA que se puede detectar de diferentes
modos.
 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:

• Las enzimas de restricción son endonucleasas que clivan (hidrolizan)

en una forma específica puentes fosfodiéster 3' - 5' entre pares de
bases adyacentes en la doble cadena de DNA. Las enzimas de
restricción reciben su nombre de la bacteria de la que fueron
aisladas por ejemplo: EcoRI de Escherichia coli, BamHI de Bacillus
amyloliquefaciens. Las tres primeras letras en el nombre de la
enzima, corresponden la primera al genero (E) y las otras dos a la
especie (co). Éstas pueden ir seguidas por la designación de una
cepa ( R) y un número romano (I) para indicar el orden del
descubrimiento. El tipo más común de enzimas de restricción (tipo
II) usado en la tecnología del DNA recombinante proviene de
bacterias y no requiere fuente de energía para el clivaje del puente.
Requiere en cambio iones Mg++ para la unión específica al DNA y
posterior clivaje
 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
• Las enzimas de restricción cortan dejando
extremos cohesivos o romos. Los extremos
cohesivos o adherentes son generados cuando la
enzima corta las dos hebras asimétricamente,
dejando los extremos de cada hebra de simple
cadena complementarias entre sí. Los extremos
cohesivos o adherentes son particularmente
útiles en la construcción de moléculas de ADN
híbridas o quiméricas. Por otro lado, los extremos
romos son generados cuando la enzima corta las
dos hebras por el mismo lugar, generando dos
extremos doble cadena.
 Enzimas de Restricción
• Enzimas de restricción. Este tipo de endonucleasas puede dejar dos tipos de
extremos cohesivos o romos. En promedio, un genoma de la bacteria E. coli
tendría alrededor de 800 sitios de clivaje de EcoRI y el genoma humano tendría
alrededor de 800.000 sitios de clivaje de EcoRI. Los fragmentos de DNA generados
por digestión con enzimas de restricción pueden ser determinados por
electroforesis en gel de agarosa. Este método toma en cuenta la porosidad del
agar, símil agarosa a través del cual pequeños fragmentos de DNA migran más
rápido que los fragmentos de mayor tamaño en presencia de una solución buffer y
un campo eléctrico. 3.2.DNA LIGASA.
• La DNA ligasa es una enzima que cataliza la formación de puentes fosfodiéster
entre los extremos adyacentes 3' OH y 5' fosfato en el DNA. Para la actividad la
enzima
• requiere Mg++ y una unión covalente, derivada del ATP en el caso de la DNA ligasa
del bacteriófago T4. La enzima T4 puede unir covalentemente moléculas de DNA
con extremos cohesivos compatibles (por ejemplo, unión de hidrógeno del
extremo más largo 5' de EcoRI digiriendo fragmentos de DNA) y también
fragmentos de DNA con extremos sin punta. El uso en la digestión / restricción del
DNA seguido por unión covalente de extremos cohesivos de diferentes fragmentos
de DNA forma la base de la enzimología del DNA recombinante
 ACCIÓN DE LA DNA LIGASA
• PLÁSMIDOS Y CLONACIÓN DE DNA EXTRAÑO.
• Los plásmidos son pequeñas moléculas de DNA (de 5.000 pb
aproximadamente) que se replican en forma autónoma en células
bacterianas.
• Son círculos covalentemente cerrados de DNA de doble cadena. La
mayoría de los plásmidos contienen genes resistentes a
antibióticos, los que permiten el crecimiento de células bacterianas
refugiando a los plásmidos bajo condiciones selectivas. Los
ejemplos de genes resistentes a antibióticos son los que codifican
para la ß lactamasa o neomicina fosfotransferasa, enzimas que
inactivan ampicilina o aminoglucósidos respectivamente.
•
•
SITIOS DE REPLICACION IMPORTANTES
• Sitios de replicación importantes PstI, EcoRI, BamHI,
SalI, PvuII. Origen de replicación (ori). Los plásmidos
contienen uno o más genes de resistencia a
antibióticos y son capaces de autorreplicarse, ya que
contienen una secuencia de iniciación. Esto les permite
replicarse de manera independiente del ADN
genómico. Debido a su tamaño relativamente
pequeño, los plásmidos contienen solo algunos únicos
sitios de clivaje de enzimas de restricción. Luego de la
digestión de un plásmido en un único sitio de
restricción el plásmido circular se vuelve lineal.
• Se puede crear una molécula de ADN recombinante
usando un plásmido. Este proceso
 CONTINUACIÓN
• 1. Se corta el ADN circular del plásmido con enzimas de restricción, para
generar extremos cohesivos.
• 2. Se corta el ADN que se quiere multiplicar. Asegurándose que los
extremos del plásmido y los del ADN a insertar sean complementarios y
puedan unirse.
• 3. Se une el gen que se desea introducir (inserto) por medio de la enzima
ADN-ligasa y luego se introduce el plásmido inserto en bacterias.
• 4. Se selecciona las bacterias que hayan introducido el plásmido con la
ayuda de antibióticos. Dado que los plásmidos contienen un gen de
resistencia a antibiótico, al exponer las bacterias a ese antibiótico, sólo las
que hayan incorporado el plásmido (y con él la resistencia) sobrevivirán,
mientras que las que no lo tengan morirán. Esta es una manera
relativamente eficaz de obtener millones de copias del ADN incorporado.
Dado que todas las copias del gen provienen de una sola molécula
multiplicada a partir de una única bacteria que dio origen a la colonia, esta
técnica lleva el nombre de clonación. Figura 6: Clonación de DNA
 CONTINUACIÓN
• La unión por la DNA ligasa forma una molécula de DNA
recombinante con una estructura covalentemente cerrada.
Una molécula recombinante circular puede ingresar a la
célula bacteriana, replicarse y por virtud el gen del
plásmido con resistencia a antibióticos, transformar la
célula normal sensitiva a una que crecerá en presencia de
antibióticos. Si la unión es realizada en un tubo de prueba
con millones de moléculas plásmidas digeridas por EcoRI y
millones de fragmentos de DNA extraño único con
extremos cohesivos (por ejemplo genoma humano digerido
con EcoRI) son formadas millones de moléculas de DNA
recombinante, cada una conteniendo el mismo DNA vector
plásmido pero con un fragmento único (gen en algunos
casos) de DNA humano.
 CONTINUACIÓN
• Cuando células bacterianas receptoras son transformadas con esta
mezcla y colocadas en placas de agar conteniendo el antibiótico
apropiado, solo una célula conteniendo un plásmido crecerá y
formará una colonia visible conteniendo millones de bacterias,
todas con el idéntico plásmido vector y el DNA extraño inserto
(clones). De un pequeño número de placas de agar es posible tener
suficientes clones bacterianos individuales, así cada gen en el
genoma humano es clonado en una colonia bacteriana única.
• Los tipos de vectores que se utilizan suelen ser plásmidos, virus
como el fago lambda, cromosomas creados de forma artificial y
quimeras (DNA quimérico). Para clonar genes específicos se puede
preparar una biblioteca genómica que consiste en una colección de
fragmentos de DNA genómicos, clonados en vectores (plásmidos,
bacteriófagos o cósmidos), que representan el genoma entero del
organismo.
 OTRA ALTERNATIVA
• Otra alternativa son las bibliotecas de cDNA (DNA
complementario) que representan la colección completa de
los mRNA que se sintetizan en un momento en una célula
dada. El DNA extraño clonado que está en esta biblioteca
son moléculas de DNA de doble cadena sintetizadas por la
enzima transcriptasa inversa a partir de la población de
RNA mensajeros, moldes encontrados en un tejido
específico. Así una biblioteca cDNA contiene regiones
clonadas codificantes para todas las proteínas expresadas
en un tejido particular y variará de tejido en tejido.
• El DNA clonado no contendrá intrones (a diferencia del
DNA genómico) y por consiguiente permite la expresión
directa del RNAm transcripto a proteína in Vitro o en
bacteria. Biblioteca de cDNA.