Absorción - Absorbitividad *

Proceso de Absorción
La energía de excitación a una molécula proveniente de un fotón durante el
proceso de absorción y se representa así:

A + hf  A*  A + calor

donde:
A es el absorbente en su estado de energía bajo,
A* es el absorbente en su nuevo estado de excitación energética
hf representan a la constante de Planck y la frecuencia respectivamente, es la
energía de fotón.
 La energía del fotón incidente posee una longitud de onda (λ)
A* es inestable y rápidamente revierte a su estado energético más bajo, perdiendo
así la energía térmica correspondiente.
La absorción de determinadas longitudes de onda depende de la estructura de la
molécula absorbente (absortividad, “a”)
 Ley de Beer

Po

b dx P

Po; es la potencia de la radiación incidente perpendicular a la superficie de área S absorbente.

b; es el ancho del material.
P; es el potencial de la radiación después de incidir perpendicular a la superficie de área S
absorbente.
S; es el área de una sección transversal.
dx; es el espesor infinitesimal de la especia absorbente
Consideremos un cuerpo de una sección de área S y de ancho dx. Dentro de cada sección hay dn
partículas absorbente (átomos, moléculas o iones); asociada a cada partícula podemos imaginar una
superficie en la que se puede producir captura de fotones. Si un fotón llega por casualidad a una de
éstas áreas, se producirá absorción inmediatamente. El área total proyectada de éstas superficies de
captura en la sección se designa como dS y la probabilidad de captura al área total es dS/S. Es un
promedio estadístico esta razón representa la probabilidad de captura de fotones dentro de la
sección.

La potencia del haz Px que penetra en la sección es proporcional al número de fotones por cm2 por
segundo, y dPx representa la cantidad eliminada de la sección; la fracción es entonces –dPx/Px y
esta razón es en promedio igual a la probabilidad de captura.
dPx dS
 
Px S

dS  n

 es una constante de proporcionalidad que puede denominarse sección transversal de captura.

dI x
I n dS
  
Io I 0 S
x

Integrando: I n Io n
 ln  log 
Io S I 2.303 S
 S
V
cm 2  Io nb
log 
b I 2.303V

1000n
c  mol / litro Io 6.023 x 1023 bc
log 
6.023x1023 V I 2.303 x 1000

Io
Finalmente: log  bc  A
I

Esta última ecuación se aplica a todos los tipos de radiación electromagnética, a soluciones, a gases
y sólidos, se cono c omo ley de Lambert- Beer
A = absorbancia
 = constante se llama absortividad molar
c = concentración en moles litro (Molartidad)
b = longitud de la trayectoria en cm.

I
log  log T  log T  A
Io

T = transmitancia.
Ley de Lambert: cuando un rayo de luz monocromática (I0) pasa a través de un
medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente (I) a medida que
la longitud del medio absorbente aumenta
I = I0e-bc

I0 I1 I0 I2 I0 I3

1 cm. 2 cm. 3 cm.

longitud de la celda

I1 > I2 > I3
Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio
absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la
concentración del medio absorbente aumenta
I = I0e-Ac

I0 I I0 I I0 I
Lo que significa que combinando ambas leyes se crea la Ley de Beer-Lambert
donde la fracción de luz incidente que es absorbida por una solución es
proporcional a la concentración de soluto y al espesor de la sustancia atravesada
por la luz. La relación entre la luz incidente (I0) y la reflejada (I) dará una idea de
la cantidad de radiación que ha sido absorbida por la muestra.
Ejemplo:
Una absorbancia de 0.6 ¿a que equivale en % T?
log % T = 2 – 0.6 = 1.4
log % T = 1.4 %T = 1 / log1.4
Aplicando antilog. A = 1.4 = 15 % de transmitancia

Obtención de absorbancia a partir de un valor de % de transmitancia

recordando:
A = log 1/T
Ejemplo de cálculo
%T = 30
T = 0.30
Sustituyendo (1/T) 1/0.30 = 3.33
Log 3.33 = 0.523 de absorbancia
La representación gráfica correspondiente a absorbancia y transmitancia en un
gradiente de concentraciones es la siguiente:

Conce
ntraci
ón
Se le llama espectrofotometría a la medición de la cantidad de energía
radiante que absorbe una molécula o un elemento en su estado puro, en
función de la longitud de onda de la radiación electromagnética.
¿Cómo se puede medir la radiación que emiten o absorben los cuerpos?.
Un aparato capaz de obtener el espectro de una radiación, es decir, de separar la
radiación en sus componentes, se llama un espectroscopio.
Si el aparato es capaz de fotografiarla se llama un espectrógrafo, y
Si es capaz de medirla diremos que se trata de un espectrómetro.
Cuando es capaz de medir también la intensidad de la radiación, se llama
espectrofotómetro.
 1817
Espectroscopio

Espectógrafo
Espectómetro

De Imagen de Marte vista con

fluorescencia ayuda de espectómetro de
rayos Gamma

De Emisión
Óptica
Para metales
Colorimetría y Espectrofotometría como procedimientos
analíticos *

Las técnicas colorimétricas se fundamentan con la medición de la absorción de

radiación visible por sustancias coloreadas.

Sin embargo, cuando una muestra a determinar no posee coloración, es

necesario llevar a cabo un tratamiento de color empleando substancias que que
reaccionen de forma proporcional con el compuesto de interés
La diferencia entre colorimetría y espectrofotometría consiste en el tipo de
instrumental empleado:

El colorímetro es un aparato en donde la longitud de onda se selecciona por medio de

filtros ópticos coloreados que son insertados en este.

En el espectrofotómetro la longitud de onda es seleccionada mediante dispositivos

monocromadores los cuales están integrados a la máquina.
Algunos de los procedimientos colorimétricos o espectrofotométricos con los
que se cuenta para precisar la concentración de una sustancia en solución son
los siguientes:

Referencia de color
Colorímetro Klett
Espectrofotómetro
 M.C.I/2005

FOTOCOLORÍMETRO KLETT /
SUMMERSON
Fundamento de colorímetro Klett
Una solución que absorbe el rojo pero no el amarillo y el azul con la combinación
de estos dará un color verde.

Luz incidente Luz absorbida Luz emergente

Rojo
Amarillo Verde
Azul
Amarillo
Azul }
Por lo anterior podemos aplicar un sencillo método para precisar con cual
filtro podríamos leer una solución dependiendo el color de esta

Cuando la solución sea roja no se deberá utilizar un filtro de color rojo

porque justamente ese es el color que no absorbe.

En relación a esto, en el manual del fotocolorimetro Klett aparece la siguiente

tabla que se puede utilizar para determinar que filtro se debe emplear de
acuerdo al color de la solución a estudiar:

Color del filtro Rango espectral Soluciones coloreadas

Roja, Naranja,
Azul 400-465
Amarilla, Verde, Turbias
Roja, Amarilla, Violeta,
Verde 500-570
Naranja, Azul
Rojo 640-700 Azul, Verde, Amarilla
A menudo se hace referencia a la “estrella de colores” para facilitar el recordar la
elección del color de filtro para lectura colorimétrica. Para soluciones de color azul verde
y amarilla correspondería un filtro rojo. Para soluciones de color rojo, naranja o
amarrillo seleccionaríamos un filtro color azul. Finalmente para soluciones con color
verde, azul o amarilla elegiríamos un filtro rojo.
Manejo del Fotocolorímetro
1. Confirmar, que el filtro (A) adecuado se encuentre dentro del portafiltros (B) y
este en su lugar (C)
2. Compruebe que la aguja indicadora (D) este en el centro, en cero; si no es así
ajuste a cero con la perilla (E) que se localiza en la parte superior; siempre y
cuando la lámpara se encuentre apagada
3. La lámpara (F) se enciende con el apagador (G), deje calentar entre 5 y 10
minutos.
4. Ajuste la escala del potenciómetro (H) con la perilla correspondiente (I) a cero
5. Coloque la cubeta (limpia) (J) con el “blanco”, en su sitio (K) y encienda con el
interruptor (L)
6. Mediante la perilla (M) del galvanómetro , se acopla la lectura a cero , lo que
implica que la aguja (D) y la escala (H) deben estar en cero.
7. Para leer las soluciones problema : Hay que retirar de la cubeta el “blanco” y
colocar la solución problema, la aguja (D) se desviará de su posición , es
necesario nuevamente ajustar (con I) a cero, la lectura que proporcione la escala
(H) es la correspondiente al “problema “
Limitaciones instrumentales y químicas:

1. Limitaciones de la ley de Beer: las soluciones deben ser diluidas, por la

interacción de las concentraciones y la absorción de los solutos. ( generalmente
deben ser menor de 0.01 M)
2. La absortividad, depende del índice de refracción de la solución y ésta depende
de la concentración , por tanto debe incluirse una corrección, en la ecuación:
 
Po  e 
log  bc
P   2  2 2 
 
3. Las desviaciones químicas ocurren debido a las asociación, disociación o
reacción de las sustancias absorbentes, con el disolvente.
4. La desviación instrumental, se debe a la exigencia de la ley de Beer de usar una
radiación monocromática, lo contrario ocasiona una desviación.
CUIDADOS

 Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse turbias o con precipitados.

 El volumen de la muestra no debe ser excesivo para evitar que se desborde, en
caso de que sucediera, se debe limpiar con un paño limpio o papel absorbente
suave, para evitar rayarla.
 La cantidad a adicionar es, máximo, hasta ¾ partes de la cubeta

 No se deben derramar líquidos, sobre todo solventes, ácidos o álcalis; dentro del
contenedor de la cubeta, se puede dañar parte del mecanismo
 El fotocolorímetro nunca se debe encender sin filtro.
 No deje que se sobrecaliente, mantenga apagado si no lo utiliza.
ESPECTROFOTÓMETRO
Un espectrofotómetro es un instrumento que descompone un haz de luz (haz de
radiación electromagnético), separándolo en bandas de longitudes de onda
específicas, formando un espectro atravesado por numerosas líneas oscuras y
claras, semejante a un código de barras del objeto, con el propósito de identificar,
calificar y cuantificar su energía
Distribución de la luz en el espectrofotómetro
Espectrofotómetro Mecanismo Interno
COLOR LONGITUD DE ONDA (l)
Rojo (R) 700 nm

Verde (G) 546.1 nm

435.8 nm
Azul (B)
Es usual que al seguir una “receta” para la determinación de la concentración de
un compuesto en particular se indica una longitud de onda (l) específica a la que
hay que leer con el colorímetro o espectrofotómetro.

¿Porque leer a diferentes l (longitudes de onda) compuestos parecidos pero

diferentes?

La explicación radica en el hecho de que cada producto químico se caracteriza

por zonas del espectro visible o no visible en el cual absorbe con mayor o menor
intensidad conformando en su conjunto el espectro de absorción de tal sustancia.
Cada compuesto (de complejo a simple) presenta un espectro de absorción
característico

Absorbancia

Las longitudes de onda con mayor absorción (picos) corresponderán de forma general a
aquellas con las que se leerá la muestra para determinar su concentración

Absorbancia

La relación entre la absorbancia por una sustancia a una l determinada y su

concentración es directamente proporcional es decir: a mayor concentración mayor
proporción de luz absorbida.

Absorbancia
Conc.
Así, el espectro de absorción de la clorofila es:
 Colorante común, la Rodamina 6G en Metanol..

Espectro de Absorción (línea contínua) y Espectro de Transmisión (línea

discontínua).
celda de 5uL

La muestra se coloca en una cubeta* de forma

prismática
Se asume que el tubo, celda o “cubeta” en la cual se vierte la solución a leer no
debe desviar la trayectoria de la luz como requisito para el cumplimiento de la
ley de Beer
Como el cuarzo aparte de ser muy transparente presenta un comportamiento
constante ante la variación de la longitud de onda es común que las celdas del
espectrofotómetro o colorímetro sean de este material .
 Curva Patrón

El razonamiento para el proceso de determinación de una

concentración desconocida es:
A partir de concentraciones conocidas de las cuales también se sabe su
absorbancia (curva patrón), es posible interpolar (intercalar) la
concentración del problema sabiendo su absorbancia (línea roja en
figura siguiente)
 CURVA PATRÓN

0.6

A 0.5 Absorbancia del problema

B
S
0 0.4
R
B
A 0.3

N
C
0.2
Interpolación
I
A

0.1

0
0 2 4 6 8 10 12

Concentración mg/lt
Con base en que la Absorbancia guarda una relación lineal con la
concentración, se comprende la existencia de una relación de proporcionalidad
entre la Absorbancia y la concentración:

A1 / A2 = C1 / C2
Donde:
A1 = Absorbancia del problema.
A2 = Absorbancia de un estándar de concentración conocida.
C1 = Concentración del problema.
C2 = Concentración del estándar.

Si despejamos C1 = Concentración del problema

A1 (problema) * Conc estándar

Conc. (problema) =
A2 (estándar)
Ejemplo de curva patrón para la determinación de safranina; donde se solubiliza
este colorante únicamente en agua siendo por tanto el agua misma el tubo blanco o
de referencia para la calibración del equipo (colorímetro o espectrofotómetro)

TUBO Stock de Safranina (3 x10 -4 g/ml) ml Agua Destilada ml

1 0 10
2 0.05 9.95
3 0.10 9.9
4 0.20 9.8
5 0.40 9.6
6 0.80 9.2
En este ejemplo de determinación de Glucosa, en la preparación de los tubos para la
lectura de la curva patrón, se incluyen más elementos y por lo cual el tubo “blanco”
(0) contiene todos los componentes excepto la glucosa con el fin de poder calibrar
la absorbancia del equipo a cero

Compuesto 1 (blanco) 2 3 4 5 6 7
Glucosa 0,1 mg/ml (mL) 0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Agua destilada (mL) 1.0 0.4 0.9 0.8 0.2 0.6 0.0
Fenol al 5% (mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Acido sulfúrico (mL) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
RESULTADO de la curva patrón anterior

Absorbancia en el Espectrofotómetro a 490 nm

Curva de calibración de glucosa

Tubos Absorbancia 1
1 0 0.8

Absorbancia
2 0.135
0.6
3 0.253
0.4
4 0.417
5 0.658 0.2
6 0.574 0
7 0.768 1 2 3 4 5 6 7
Tubos
Un aspecto importante de la evaluación espectrofotométrica, es que muchas
moléculas orgánicas no absorben en el intervalo del espectro visible sino en el
rango de longitudes de onda acordes al ultravioleta o al infrarrojo

Por lo que es común, actualmente, que la mayoría de los espectrofotómetros,

actuales, se encuentren provistos con lo necesario para leer en de tales
intervalos

Así, los grupos carbonilo presentes en los aldehídos (RCHO), cetonas (RCOR),
ácidos carboxílicos (RCOOH), l ésteres (RCOOR´) y amidas (RCONHR´) dan
lugar a absorciones intensas en la región del espectro de infrarrojo situada entre
1780-1640 cm-1.
Absorciones máximas (picos de absorción) de algunos compuestos que absorben en la
región ultravioleta:
Grupos funcionales cuyos picos de absorción se localizan en la región del
infrarojo
 Tipos de Espectrofotómetro

Existen en la actualidad diversos tipos de aparatos con los mismos principios los hay
mecánicos y digitales; unos miden solo la luz visible, otros son más precisos y
miden también luz U.V. , Infrarroja, de absorción atómica (AA), fluorescencia de
rayos-X de emisión de plasma (ICP),, multipropósitos (para medir directamente la
solución con suspensión, muestras sólidas y biológicas), acoplado a masas, etc.
 MCI MCI
Para medir Luz Visible
Para medir Luz Visible y U.V.

MCI

Para medir Luz Visible y U.V.

Diferentes tipos de espectrofotómetros
Spectronic 20 D Spectrónic 20
Partes del Spectronic 20 D
 Manejo de espectrofotómetro

En la siguiente diapositiva se les proporciona el instructivo para el manejo el

espectrofotómetro Modelo Spectronic 20.
 Manejo de espectrofotómetro

 Prender el aparato (a)10 minutos antes de utilizarse, se activará la luz roja de

encendido (b).
 Seleccionar la longitud de onda con el botón (c).
 Ajuste (con a) a 0% de transmitancia, con la tapa cerrada y sin muestra.
 Insertar la cubeta con el blanco en su sección (d).

b
d
c

a
 Ajustar (con e) a 100% transmitancia (0 absorbancia)
 Retirar el blanco de la cubeta, agregarle la muestra problema, e insertar en su
espacio, bajar la tapa.
 La aguja (d) del lector se deslizará sobre la escala (f) , se lee en % de
transmitancia ó en unidades de absorbancia

e
 CUIDADOS

 Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse turbias o con precipitados.

 El volumen de la muestra en la cubeta, no debe ser excesivo para evitar que se
desborde, en caso de que sucediera, se debe limpiar con un paño limpio o papel
absorbente suave, para evitar rayarla.
 La cubeta se sujeta por los lados opacos.
 La cantidad a adicionar es, máximo, hasta ¾ partes de la cubeta
 No se deben derramar líquidos, sobre todo solventes, ácidos o álcalis; dentro del
contenedor de la cubeta, se puede dañar parte del mecanismo
 Se debe mantener, el espectrofotómetro, limpio y libre de humedad