Biotecnología Prof.

Tamara Zilocchi

Genes- Vectores- Bibliotecas de ADN.

 ● Una molécula de ADN se divide en unidades funcionales llamadas
genes.
● Cada gen proporciona las instrucciones para formar un producto
funcional 🡪 una molécula necesaria para desempeñar un trabajo
en la célula.

Expresió ● El producto funcional de la mayoría de los genes es un

polipéptido, pero los genes también codifican para moléculas
funcionales como el ARNt, el ARNr y ARN regulatorio.
n
genética
Recordemos…
• Durante la expresión de un gen codificante de
proteína, la información fluye de ADN →ARN
→proteína.

• Este flujo de información se conoce como el dogma

central de la biología molecular.

• Los genes no codificantes (genes que producen ARN

funcionales) también se transcriben para producir
ARN, pero este ARN no se traduce en un polipéptido.

• Para cualquier tipo de gen, el proceso de pasar de

ADN a producto funcional se conoce como expresión
génica.
 El
mítico
gen!!

● Es importante distinguir que los genes se encuentran interrumpidos

por tramos de ADN que no son codificantes funcionales.
● Al igual que una frase tiene espacios entre las palabras, los genes se
componen de exones (palabras) e intrones (espacios).
● Un gen sería como esta frase.
● La expresión génica se da cuando se "enciende" un gen en el ADN, es decir, cuando se usa
para producir una proteína especifica.
● No todos los genes se encienden al mismo tiempo, ni en las mismas células o partes del
cuerpo.
● Varios factores controlan cuánto se transcribe un gen. Por ejemplo, el grado con el que el
ADN de un gen esté enrollado alrededor de sus proteínas de apoyo para formar cromatina,
puede afectar la disponibilidad de ese gen para la transcripción.
● Sin embargo, las proteínas llamadas factores de transcripción tienen un papel
particularmente fundamental en la regulación de la transcripción determinando qué genes
están activos en diferentes partes del cuerpo.

¿Se acuerdan que en eucariotas

la ARN polimerasa necesitaba de
factores de transcripción para
unirse al promotor?
 ● ACTIVADORES: ayudan a que los factores generales de transcripción y/o
la ARN polimerasa se unan al promotor.
Un factor de
transcripción típico se
une al ADN en cierta
secuencia objetivo.

Una vez unido, el

factor de
transcripción hace ● REPRESORES: un represor puede estorbar a los factores basales de
que sea más fácil, o transcripción o a la ARN polimerasa, de manera que no puedan unirse al
más difícil, que la promotor e iniciar la transcripción.
ARN polimerasa se
una al promotor del
gen.
 Región sin
traducción

● Los potenciadores son conjuntos lejanos de sitio de unión de

activadores. Suelen encontrarse alrededor de 50 pares de bases
“upstream” del promotor, pero también pueden estar ubicados
“downstream”.
● Los silenciadores son conjuntos lejanos de sitio de unión de
represores.
 Lógica celular y factores
de transcripción
● Las células pueden detectar información y
combinarla para determinar la respuesta
correcta.
● Muchos genes están bajo el control de diversos
factores de transcripción y se requiere una
combinación específica para encender un gen 🡪
Regulación combinatoria.
● Por ejemplo, un gen podría expresarse solo si
están presentes los activadores A y B, y si el
represor C está ausente.
● El uso de múltiples factores de transcripción para
regular un gen significa que se pueden integrar
diferentes fuentes de información en un solo
resultado.
Y con las bacterias… ¿Qué pasa?

● Al igual que los organismos eucariontes, las

bacterias pueden y deben controlar la expresión
génica.
● A diferencia de los organismos eucariontes,
contienen varios genes relacionados, situados
juntos y bajo el control de un solo promotor
organizados en ciertos ordenamientos llamados
Operones.
● No todos los genes de la bacteria están dispuestos
de esta manera, también los hay independientes 🡪
llamados genes constitutivos.
● Los operones no solo están compuestos de las secuencias codificadoras de los
genes, también contienen secuencias de ADN reguladoras que controlan la
transcripción del operón.
● Típicamente, estas secuencias son los sitios de unión de las proteínas reguladoras,
que controlan cuánto se transcribe el operón.
● La mayoría de los operones tienen otras secuencias de ADN reguladoras además del
promotor 🡪 Estas secuencias son sitios de unión de las proteínas reguladoras que
"suben" o "bajan" la expresión del operón.
● Algunas proteínas reguladoras son represores que se unen a secciones del ADN llamadas
operadores. Cuando se une a su operador, un represor reduce la transcripción (por ejemplo, al
bloquear la ARN polimerasa para que no pueda avanzar sobre el ADN).

● Algunas proteínas reguladoras son activadores. Cuando un activador se une a su sitio de fijación del
ADN, aumenta la transcripción del operón (por ejemplo, al ayudar a la ARN polimerasa a pegarse al
promotor).
 ● Algunos operones generalmente están “apagados”, pero pueden
"encenderse" con una molécula pequeña. La molécula se llama inductor
Muchas proteínas y se dice que el operón es inducible 🡪 Ej: Operón lac.
reguladoras podrán
“apagarse” y
● Algunos operones generalmente están “encendidos”, pero pueden
“encenderse” al "apagarse" con una molécula pequeña. La molécula se llama
interaccionar con correpresor y se dice que el operón es reprimible 🡪 Ej Operón trp.
moléculas especificas.

Este mecanismo le
permite a la bacteria
adaptarse a sus
necesidades
nutricionales.
¡Basta de bacterias!
¡Volvamos a los
humanos!
n poco mas
e expresión● Siguiendo nuestro dogma central de la biología molecular, el paso siguiente a la
transcripción será la traducción.
génica…● En organismos eucariontes, el gen necesita ser procesado (recuerden a los intrones)
🡪 Cuando un gen eucarionte se transcribe en el núcleo, el transcrito primario
(molécula de ARN recién hecha) todavía no se considera un ARN mensajero, sino que
es una molécula “inmadura” llamada pre-ARNm.
● El pre-ARNm tiene que pasar por algunas modificaciones para convertirse en una
molécula madura de ARNm que puede salir del núcleo y ser traducida.
• Añadir un cap 5' al inicio del ARN

• Añadir una cola de poli-A (cola de nucleótidos A) al final del

ARN

• Cortar y quitar los intrones, o secuencias "basura", y pegar las

secuencias restantes, las buenas (exones)
 ● Ambos extremos de un pre-ARNm se modifican con la adición de
grupos químicos.
cap 5' y la cola ● El grupo del inicio (extremo 5') se llama cap y el grupo del final
de poli-A (extremo 3') se llama cola.
● El cap y la cola protegen el transcrito, ayudan a que sea exportado
del núcleo y traducido en los ribosomas que se encuentran en el
citosol.
 Cola
Cap5’
Es un nucleótido
poli-A Es una cadena de 100 a
modificado de guanina, 300 nucleótidos de
contiene un grupo metilo. adenina.

Se lee una señal de

poliadenilación en la
molécula de ARN, una
Se agrega al primer
enzima corta en 2 al ARN
nucleótido del transcripto.
en este sitio y otra agrega
los nucleótidos en el
extremo cortado.

Protege al trascripto de la Le brinda mayor

degradación y ayuda al estabilidad al transcripto y
ribosoma a unirse al lo ayuda a ser
ARNm. transportado hacia el
citosol.
● El tercer evento más importante en el procesamiento del ARN que sucede en las células se conoce
como empalme de ARN.
● En el empalme de ARN, ciertas regiones del transcrito del pre-ARNm, conocidas como intrones, son
reconocidas y eliminadas por un complejo enzimático especializado llamado espliceosoma.
● Los fragmentos de ARN que no se eliminan se llaman exones y el espliceosoma los “pega” para
generar ARNm final maduro.

Empalme de ADN
En un principio se trabajó con la hipótesis 1 gen 1 enzima.

Posteriormente se amplió el concepto a que no todas las

proteínas codificadas en los genes eran enzimas, y a que
además, también codificaban para segmentos regulatorios.

Con el concepto de empalme, lo que se descubrió es que

“secretamente” un gen puede codificar un numero mayor de
proteínas mediante un proceso llamado Empalme Alternativo.

¿Qué significa? 🡪 puede hacerse mas de un ARNm de un

mismo gen, al unir diferentes exones entre si.
A lo largo de la cursada
fuimos incorporando
conceptos sobre el ADN
Conceptos sobre
recombinante, antes de
seguir avanzando
profundicemos un poco
mas en algunos.
herramientas del
ADN recombinante
Enzimas de
restricción,
vectores y la
ADN ligasa
son
fundamental
es para la
recombinaci
ón del ADN.
VECTOR 🡪 Molécula de ADN de doble cadena con capacidad de albergar
un fragmento de ADN exógeno.

Vectores de clonación 🡪 su finalidad es el almacenamiento de secuencias y

la obtención de grandes cantidades del ADN insertado en la molécula
recombinante.
-Plásmidos, fagos, fagémidos, cósmidos, cromosomas artificiales de
bacterias y levaduras.

Vectores de expresión 🡪 su objetivo es producir un transcripto (ARN) o la

proteína producto de ese transcripto.
-Plásmidos o fagos.
Un vector de clonación
contiene elementos como
el ORI, el SMC y
marcadores de selección.
Un vector de expresión,
además de contener los
elementos mencionados,
contiene un promotor y un
sitio IRES (sitio de entrada
al ribosoma) así como una
secuencia de
poliadenilación.
 ¿Cuáles son las características que buscamos
en los vectores de clonación?

Tamaño 🡪 deberán ser lo suficientemente pequeños como para poder separarlos fácilmente del ADN cromosómico
de la bacteria hospedadora.

Origen de la replicación 🡪 sitio que les permite replicarse de forma separada al cromosoma de la célula
hospedadora.

Sitio de clonación múltiple / polylinker 🡪 fragmento de ADN con secuencias de reconocimiento para
muchas enzimas de restricción diferentes.

Genes marcadores para seleccionar 🡪 permiten la selección e identificación de las bacterias

transformadas. (ej: Gen ampR, tetR y lacZ).

Secuencias del promotor ARN polimerasa 🡪 utilizadas para la transcripción de ARN in vivo (producción) e in
 Tipos de
vectores

Naturales Artificiales

Cromosomas Cromosomas
Plásmidos Bacteriógrafos Vectores Ti Cósmidos
BAC YAC

Clasificación de vectores
 ● Son virus que infectan naturalmente a bacterias y se comportan
como parásitos intracelulares obligatorios, haciendo uso de la
maquinaria biosintética de las bacterias.
● Se replican de forma autónoma.
● Portan información genética.

Bacteriógrafo ● Pueden conferirle nuevas propiedades a la bacteria.

● Se pueden utilizar como vectores de expresión de proteínas.
s
● Para convertirlo en vector, el bacteriógrafo “silvestre” deberá ser
modificado genéticamente 🡪 adicionando sitios de restricción
específicos y eliminando aquellos genes que no se requieren para
la replicación.
● Permiten incorporar fragmentos de ADN de mayor longitud que
los plásmidos (de hasta 23/25kb).
● El ADN del bacteriógrafo lambda fue uno de los primeros
vectores utilizados en clonación.
● El ADN clonado se inserta en el centro del cromosoma
lambda, y después son empaquetados en partículas virales in
vitro, utilizando estos fagos para infectar a E.coli.
● Los extremos cohesivos (12 nucleótidos) a los extremos del
cromosoma lambda le permite circularizarse y luego replicarse al
infectar a E.Coli 🡪 ciclo litico, crea zonas llamadas placas que
aparecen como manchas mas claras en el césped bacteriano y
nos permiten identificar las partículas recombinantes.
 ● Los cósmidos permiten la aceptación de
insertos de hasta 45kb (rango 20-45).
● Son vectores híbridos de ADN de un
plásmido (proporciona resistencia a los
antibióticos y un ORI ) y los sitos COS
del bacteriógrafo (le permite
Cósmidos empaquetar ADN).
● Se clona ADN en un sitio de restricción y
el cósmido se empaqueta en partículas
virales 🡪 siguiendo el mismo
mecanismo que los bacteriógrafos.
● Detectamos las colonias recombinantes
mediante la resistencia antibiótica.
 ● Pequeñas moléculas circulares de ADN que se replican independientes
del material cromosómico.
● Los vectores de expresión (de proteínas) permiten la síntesis a alto
nivel porque contienen una secuencia promotora adyacente al sitio en
el que se inserta el ADN en el plásmido.
● Son relativamente fáciles de modificar.

Plásmidos / ● Al ser formados por 2/5kb de ADN resulta mas fácil analizar los
insertos que se incorporen a ellos.
Vectores de ● Mas utilizados: pBlueescript, pUC19, pBR322, pGLO.
expresión ● Su tamaño tal como representa un beneficio, también constituye su
principal limitación.
 ● YAC 🡪 Son pequeños plásmidos que han crecido en E.Coli y han sido
introducidos en células de levadura.
Es una versión en miniatura de un cromosoma eucariota.
Contienen un ORI, marcadores de selección, dos telómeros y
un centrómero que le permiten la replicación y la segregación de
células hijas en la división celular.
Cromosomas El ADN foráneo se clona en un sitio de restricción en el centro
del YAC.
artificiales Permiten la clonación de segmentos de 200kb hasta 2mb.
BAC y YAC ● BAC🡪 Son grandes plásmidos de bajo numero de copias, en células
que contienen genes que codifican el factor F (controlan la replicación
bacteriana).
-Pueden aceptar insertos de ADN de entre 100 y 300 kb.
 ● Son plásmidos de origen natural aislados de la bacteria
Agrobacterium Tumafaciens 🡪 patógeno vegetal.
● El T-DNA codifica la síntesis de una hormona llamada auxina, que
Vectores Ti debilita la pared de la célula hospedadora provocando que las
células infectadas se agranden.
● Se utilizan para introducir genes a plantas.
 Se emplean con 2
finalidades:
-Generar el ARN producto Pueden ser plásmidos o
de la transcripción. bacteriografos.
-Producir la proteína
recombinante.

Vectores de expresión
Componentes

● Poseen los elementos básicos que también se encuentran en los vectores de clonación : ORI,
marcador de selección y sitio polylinker.
● Cuentan con por lo menos un promotor fuerte.
● Se caracterizan por constituir un sistema de inducción simple y efectivo, y tener una baja
expresión basal, siendo fácilmente transferible a otras cepas.
● Otra cosa que debe incluir es secuencias de terminación de la transcripción y de adición de la cola
poli-A a fin de proteger al transcripto de la degradación de nucleasas.
● Un factor muy importante es el sitio de unión al ribosoma, que precede el codón de inicio AUG de
la traducción. Esta secuencia es complementaria con el extremo 31 del AR 16S, cuya hibridación
permite el ensamblaje de la maquinaria del inicio de la traducción.
● A considerar también 🡪 la expresión basal de plásmido (numero de copias) que es determinada
por la fuerza del sitio de origen de replicación.
Bibliotecas
 ● Las bibliotecas son colecciones de fragmentos de ADN
clonados de un organismo en particular contenidos dentro de
bacterias o virus como hospedadores.
● Pueden almacenarse y “rastrearse” para elegir diversos genes de
¿Qué son? interés.
● Se suelen utilizar dos tipos de bibliotecas para la clonación:
-Bibliotecas de ADN genómico.
-Bibliotecas de ADN complementario (cADN).
 ● Se aísla el ADN cromosómico del tejido de interés.
● Se lo digiere con una enzima de restricción.
● Los fragmentos de ADN que surgen del proceso
anterior incluyen el genoma completo del organismo.

Bibliotecas de ● Se elige un vector de clonación y se lo digiere con la

misma enzima de restricción que al gen.
ADN ● Se utiliza la ADN ligasa para unir los fragmentos de
genómico ADN con el vector.
● Se realiza la transformación de bacterias utilizando los
vectores recombinantes.
● Como desventaja esta técnica no discrimina a los
intrones, por lo cual muchos de los clones de la
biblioteca contendrán fragmentos no codificantes.
 ● Se aísla el ARNm del tejido de interés.
● Como el ARN no puede ser cortado por enzimas de
restricción, primero se lo debe convertir en ADN
mediante el uso de la enzima Transcriptasa Inversa.
● Es de este paso que la técnica recibe su nombre 🡪 el
ADN fue sintetizado como una copia exacta del
ARNm.
Bibliotecas de ● El ARNm se degrada mediante el uso de una solución
cADN alcalina o digestión enzimática y se utiliza a la ADN
polimerasa para sintetizar una segunda hebra de ADN
y crear cADN de doble hélice.
● Es necesario agregar secuencias adaptadoras/linkers
flanqueando los extremos del cADN de modo que
puedan ser cortados por enzimas de restricción.
● Los pasos continúan como los venimos viendo,
recombinación, transformación y cultivo.
 Ventajas de la cADN por sobre las bibliotecas de
ADN genómico:

-Se clonaron genere expresados, sin intrones.

-Son mas pequeñas y con información mas concisa.

-Pueden rastrearse para aislar genes que se expresan

solo bajo ciertas condiciones en un tejido.
 Una vez que se clonan los fragmentos de ADN o se
obtiene el cADN, al momento de utilizar las
bibliotecas será necesario rastrearlas para lograr
encontrar el gen de interés.
Rastreo de la
biblioteca
La Hibridación de colonias es una de las técnicas
mas utilizadas.
Fin..
Dudas??