Pesquisas em genoma funcional

“Revolução” da pesquisa na área de ciências biológicas

Quando? Década de 90

Porque? Universalização e desenvolvimento das técnicas de DNA recombinante

- Barateamento do preço dos sequenciamento
Desenvolvimento de novas tecnologias para sequenciar DNA e proteinas

Fatos: - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados

- O genoma de duas plantas completamente sequenciado

- Genoma de Drosophila completamente sequenciado

- Genoma do camundongo completamente sequenciado

- Sequenciamento do genoma humano proximo de seu termino

Grande numero de programas de sequenciamento aleatorio de sequencias (EST)

Expressas está em andamento em vários diferentes organismos e espécies
 Consequências atuais
- Grande quantidade de informação disponível

- Formação de grandes consórcios de pesquisa: Projeto 2010

- Análise científica mais holística

Consequências futuras:
- Predição dos fenótipos que resultariam de mudancas genéticas específicas

- Identificar quais mudanças genéticas poderiam acelerar a domesticação de espécies selvagens

Facilitar a manipulacao genética que garantiria a manutenção e expansão das bases de germoplasma

Descrição dos mecanismos responsáveis pela heterose; habilidade de utilizar este fenômeno mais efetivamente

Melhor compreensão da base genética da plasticidade fenotípica

Caracterização do grupo mínimo de genes para o funcionamento de um organismo

Compreensão da base genética da evolução::: melhor compreensão da diversidade da vida na terra

Compreensão das interações entre os organismos e seu ambiente a nível de ecosistema

 Estratégia de Genoma funcional: Ex: tolerância a estresses abióticos

Descoberta de genes Estudo expressão gênica em Seleção de mutantes

larga escala
Homologia como critério para
identificar genes em bancos de cDNA macro/microarrays; EMS, radiação, T-DNA,
sequências EST e genômicas genechips transposons

Data mining Clonagem e sequênciamento

Criação e análise de um banco de dados Posição no mapa gen. ou físico;
Baseado na inserção de
Estudos das interações Testes funcionais sequência alvo

Sistema duplo-hibrido de leveduras

Complementação leved.
Phage display
Interação in vitro (crom. Afinidade, Mutante em Arabidopsis Estudos genéticos
imunoprecipitação
Superexpressão Alelismo
Aditividade
Estudos de expressão in situ Antisenso.
Epistasia
Fusão proteína com GFP Supressão por RNAi Supressão
Expressão GFP ou luciferina com o promotor

Montagem de uma combinação de genótipos em plantas transgênicas

Construção de modelos de controle dos processos envolvidos

Modificação de plantas de interesse agrícola baseados nesses modelos: modificação simultânea

da expressão de vários genes
 Transcriptoma:

Análise dos níveis de RNA

de varios genes simultaneamente

Um genoma possui varios

transcriptomas

…varios transcriptomas temporais

Ex: tempo apos sujeicao a um estresse

Ex: tempo apos uma determinada fase do desenvolvimento

…varios transcriptomas espaciais

Ex: transcriptoma celular-especifico
Ex: transcriptoma tecido-especifico
Ex: transcriptoma orgao-especifico
Etapas para a realizacao de um transcriptoma
1) Filme Macroarray.mov

2) Filme oligochip.mov
 1a Etapa de um transcriptoma

Isolamento de DNA
do banco de cDNA

Preparacao do Micro/Macroarranjo
(Micro/macroarray)
2a Etapa de um transcriptoma: produção da sonda

Duração
do protocolo:
5 horas
2a Etapa de um transcriptoma: hibridação
 3a Etapa de um transcriptoma: obtenção e análise da imagem

DNA alvo imobilizado: cDNA do genótipo tolerante

Sonda marcada com o fluorocromo “verde”: genótipo tolerante na ausência do estresse
Sonda marcada com o fluorocromo “vermelho”: genótipo tolerante na presença do estresse

Gene com reduzida expressão

na presença do estresse

a
Typhoon: Fosforescência,quimioluminescência;
b fluorescênica
d
Gene expressão acentuada
na presença do estresse

Nível de expressão na presença do estresse:

a) + x%
b) + y% (y>x)
c) -z%
Genes sem alteração
na expressão
 3a Etapa de um transcriptoma: obtenção e análise da imagem

1 1 5

2 3

4
Exemplo de data mining
5247 genes alvos 6626 genes alvos
sondas: 5 pontos temporais 19 sondas
Agrupamento
Caracterizacao
Dinamica da gene/rota 197 genes orgão-específicos
expressao raiz=64
Matriz da expressão folha=94
nos orgaos flor=36
Identificação de influorescencia=3
sequências regulatórias Agrupamento de
expressão global
Analise da abundância 347 genes constitutivos
do transcrito

8300 genes alvos

Sondas:
folha =6
Descoberta da função de genes desconhecidos raizes=4
flores=2
Análise da homologia das sequências Siliqua=3
Análise da biologia molecular do gene: co-regulação? Influorescencia=2
Confirmação pela genética reversa Plantula=2

Zhu et al. (2001) Plant Physiol Biochem 39,221-241

Exemplos de análise dos dados de um transcriptoma

Análise de agrupamento da expressão de fatores

transcripcionais na resposta a diferentes estresses
ambientais em Arabidopsis

Comparação dos transcriptomas na presença

de dois diferentes estresses
Análise de Grupos: 2 genótipos

Genótipo sensível ao
estresse salino: IR29 (direita)

Genótipo tolerante ao
estresse salino: Pokkali (esquerda)
Comparação de diferentes transcriptomas temporais durante um
processo celular
 Diferentes Transcriptomas de genes
que responde a estresses abióticos

Classe 1: genes da rota de transdução de sinal

à estresses abióticos associada ao f ator
transcripcional DREB1A

Classe 2: genes da rota de transdução de sinal

à estresses abióticos independente do f ator
transcripcional DREB1A
Confirmação dos resultados do transcriptoma: análise por Northern Blot
Classes de genes afetadas pelo estresse salino
Análise de grupos: Transcriptomas da resposta a patógeno

DNA alvo: fatores transcricionais do genoma

de Arabidopsis

Sonda 1e 2: Mutantes na síntese de ácido salicílico

Sonda 3: Mutantes na síntese de ácido jasmônico

Sonda 4: Mutantes na síntese do etileno

 Kits completos com microarranjos com oligonucleotideos e sonda
de referencias

oligonucleotideos escolhidos baseados em regioes com baixa homologia a outros genes

Vantagens:

- estringencias das pos-lavagens pode ser maior: menor nivel de hibridizacao cruzada
 Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic and cold stress

8100 genes (Genechip)

Raízes: 3 horas após
Genes > 2x = Total 2678 Genes
4oC
4 oC Manitol NaCl
Controle (200 mM) (100 mM)
Meio Fresco 2086 genes235 1008 genes 1123 genes
741 genes
58% 42% 46% 53%

78 29

65

375 106 85

NaCl Manitol
 Folhas: 3 horas após
Raízes: 3 horas após
4oC 4oC
235
243

78 29
65
78 29
375 106 85
65 Manitol
NaCl

120 68 279

NaCl Manitol
 Raízes: 27 horas após Folhas: 27 horas após

4oC 4oC

1111 1094

59 23 47 90
5 19

87 9 63 59 4 82

NaCl Manitol NaCl Manitol

Raízes: 3 horas após Folhas: 3 horas após

4oC 4oC
235 243

78 78 29
29
65 65

375 106 85 120 68 279

NaCl Manitol NaCl Manitol

 Estresse salino:
Estresse por frio:sobreposição
sobreposição3-27
3-27h
h na raiz
Raízes: Sobreposição entre 3 e 27h Folhas: Sobreposição entre 3 e 27h

4oC 4oC

173 188

9 8 5 40
2 8

22 4 6 5 4 40

NaCl Manitol NaCl Manitol

 Maioria das mudanças são estimulo-específicas: sob. De 5% e 0,5% (3-27h)

200 mM Manitol=100 mM NaClÇ 40% sobreposição foi observada em folhas (sem contato)

Frio alterou 2 vezes mais a expressão gênica do que os outros estresses

Mais induzido gene ELIP: liga a chl a

Maioria das sobreposições foram específicas à folhas ou raízes

Sobreposições podem ser perdidas em experimento que examina um limitado

número de pontos temporais ou ignora as diferenças tecido-específicas
3 -> 27h: redução em 4 vezes nas respostas comuns: respostas
mais específicas a cada estresse se seguem após o choque inicial

Transcriptoma do estresse ao frio: movimento para um novo e diferente “steady-state”

Raízes e folhas apresentam diferentes modificações no seu transcriptoma para cada estresse:
ExÇ 86% das mudanças induzidas pelo frio não são compartilhadas entre folhas e raízes

Estresses regula a expressão de mais de 370 genes cuja função é totalmente desconhecidaÇ
Pistas: especificidade de tecido e regulação por múltiplos estresses: CBF1 e ABA2 sim folha, não raiz

Maioria 2409 genes reg. pelo estresse: não tem seq tipicas dos fat. transc. CBF1 e DREB1:
a) Presença de outros elementos importantes nas sequências dos promotores
b) Um grande número de mudanças podem ser causadas por diferenças na estabilidade do
RNA ao invés da reg transc.
 Identificacao de Transcriptoma Identificacao de genes e
genotipos tolerantes e proteoma proteinas associados a tolerancia
e susceptiveis

Caracteriz. do fenotipo QTL Selecao assistida por marcadores

Locus genico candid.

Segregacao alelica
Mapeamento de
populacoes Locus quant. transcrito Identificacao de Melhoramento
Transcriptoma genes/marcadores molecular
ligados a
tolerancia
Locus quant. proteina
Proteoma

Transformacao
Mapa genetico
Caracteriz. do genotipo
 Sugestao de proposta para elaboracao de projeto genoma funcional na UFV:
1) transcriptoma

Em colaboracao:
Instituto de Quimica USP Realizado na UFV
Embrapa-Cenargem
Unicamp
UNESP-Araraquara
Múltiplas repetições : teste de repetibilidade: anãlise estatística : seq. diferentes

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