CINÉTICA ENZIMÁTICA

Diagrama mostrando a Anidrase carbónica II. A esfera a cinzento é um ion de

zinco que funciona como cofator no sítio ativo.
CINÉTICA ENZIMÁTICA
CINÉTICA ENZIMÁTICA
CINÉTICA ENZIMÁTICA
A linha em vermelho representa a reação na ausência de catalisador;
A linha em azul na presença de enzima.
S: nível de energia do(s) substrato(s);
P: nível de energia do(s) produto(s);
G: energia de Gibbs;
R: coordenada de reacção (sentidos de progressão de reacção);
ΔG'º: energia livre padrão bioquímica;
ΔG‡: energia de ativação
S-P: do(s) substrato(s);
P-S: do(s) produto(s)).
 A cinética enzimática é o estudo do mecanismo pelo qual
as enzimas ligam substratos e os transformam em
produtos.
São utilizados dados sobre a velocidade de reação de
enzimas através de ensaios enzimáticos.

Mecanismo de reação de uma enzima com substrato único.

A enzima (E) liga o substrato (S) e liberta o produto (P).
Cinética de Michaelis–Menten
Curva de saturação para uma enzima mostrando a relação
entre a concentração do substrato e a velocidade de reação;
As reações catalisadas por enzimas são saturáveis, e a sua
velocidade de catálise não indica uma resposta linear face ao
aumento de substrato.
Se a velocidade inicial da reação é medida sobre uma escala
de concentrações de substrato [S]);
a velocidade de reação (v), aumenta com o acréscimo de [S].
A medida que [S] aumenta, a enzima satura-se e a velocidade
atinge o valor máximo Vmax.
CINÉTICA ENZIMÁTICA
A saturação acontece porque, à medida que é
aumentada a concentração de substrato, aumenta
também a quantidade de enzima presente sob a forma
de complexo enzima-substrato (ES).
À velocidade máxima, Vmax, todos os centros ativos
estão ocupados (saturados) com substrato, ou seja, não
existe enzima livre para ligar mais substrato e a
concentração de complexo ES é igual à concentração de
enzima.
CINÉTICA ENZIMÁTICA
A atividade de uma enzima é geralmente descrita através
de Vmax e também da constante de Michaelis-Menten (KM),
que representa a concentração de substrato à qual se
detecta uma velocidade de reacção igual a metade de
Vmax;

Cada enzima possui um KM característico (kcat) para um

dado substrato; este parâmetro é muitas vezes usado
para demonstrar a força de ligação de um substrato à
enzima.

É também usada outra constante cinética, kcat, para

descrever o comportamento de uma enzima,
representando o número de moléculas de substrato que
podem ser catalisadas por centro ativo por segundo.
No modelo da cinética de Michaelis-Menten de uma reação com um
substrato existe uma reação bimolecular inicial entre a enzima E e o
substrato S para formar o complexo ES. Embora o mecanismo
enzimático para a reação unimolecular possa ser
bastante complexo, há tipicamente um passo na determinação da
velocidade que permite que se modele o mecanismo como um
passo catalítico simples de velocidade constante k2.

(Eq. 1).

k2 também é o valor máximo de reações enzimáticas catalisadas

por segundo.
Com baixas concentrações de
substrato [S], a enzima permanece
em equilíbrio entre a forma livre E e o
complexo enzima-substrato ES;
aumentando [S] aumenta [ES] à custa
de [E], mudando o equilíbrio para o
lado direito.

Uma vez que a velocidade de reação depende da concentração [ES], a

velocidade é sensível a pequenas alterações de [S];
Altos valores de [S], a enzima fica totalmente saturada com substrato, e
existe apenas na forma ES.
Nestas condições, a velocidade (v≈k2[E]tot=Vmax) é insensível a pequenas
alterações de [S]; assim, [E]tot é a concentração total enzimática

que é aproximadamente igual à concentração [ES] em condições de saturação

 A equação de Michaelis–Menten[7]
descreve como a velocidade de
reação v depende da posição do
equilíbrio ligado ao substrato e da
constante de velocidade k2.
Michaelis e Menten mostraram que
se k2 for bem menor que k-1
(chamada a aproximação de
equilíbrio), pode obter-se a seguinte
equação:

A constante de Michaelis Km é definida como a concentração para a qual a

velocidade da reacção enzimática é metade de Vmax.
Isto pode verificar-se ao substituir Km = [S] na equação de Michaelis-
Menten.
Se o passo para determinação da velocidade for lento, quando comparado
com a dissociação do substrato (k2 << k-1), então a constante de Michaelis
Km é aproximadamente à constante de dissociação do complexo ES,
embora tal situação seja relativamente rara.
A situação mais normal dá-se quando k2 > k-1
na por vezes chamada cinética de Briggs-
Haldane. A equação ainda se verifica em
condições mais gerais, como provém da
aproximação ao estado estacionário.
Durante o período inicial, a velocidade de
reação v é relativamente constante,
indicando que [ES] é também
aproximadamente constante (cf. equação 1):

A concentração de [ES] é dada por:

em que a constante de Michaelis Km é definida por:

 ([E] é a concentração de enzima livre);
.
Em conjunto, a fórmula geral para a
velocidade de reação v vem pela equação de
Michaelis-Menten:

A constante de especificidade kcat / Km é uma medida da eficiência de

conversão pela enzima do substrato em produto.
Usando a definição da constante de Michaelis Km, a equação escreve-
se na forma:
O gráfico de velocidade face a [S] não é linear.
Embora a baixas concentrações de substrato se mantenha linear, vai
curvando à medida que aumenta a concentração de substrato.
Antes da chegada dos computadores, que permitem ajustar
regressões não lineares de forma simples, podia chegar a ser
realmente difícil estimar os valores de Km e Vmax nos gráficos não
lineares.
Então vários pesquisadores concentrassem os seus esforços em
desenvolver métodos de linearização da equação de Michaelis-
Menten, dando como resultado o gráfico de Lineweaver-Burke
O gráfico de Lineweaver-Burk ou representação de duplo recíproco é a
forma mais comum, e simples,de mostrar os dados da cinética
enzimática.
Para tal, tomam-se os valores inversos de ambos os lados da equação
de Michaelis-Menten. Como se pode apreciar na figura da direita, o
resultado deste tipo de representação é uma linha reta cuja equação é
e = mx + c, sendo o ponto de intercecção entre a reta e o eixo das
ordenadas equivalente a 1/Vmax, e o ponto de intercepção entre a recta
e o eixo de abcissas equivalente a -1/Km.

O gráfico de Lineweaver-Burke ou do duplo recíproco mostra o significado dos

pontos de intercecção entre a reta e os eixos de ordenadas, e do gradiente da
velocidade.
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA

Esquema cinético para inibidores enzimáticos reversíveis.

E=Enzima;
S=Substrato;
ES=Complexo;
P=Produto;
I=Inibidor
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA
Inibidores enzimáticos são moléculas que reduzem ou eliminam a atividade
das enzimas.
Podem encontrar-se dois tipos:
Reversíveis: quando a remoção do inibidor restaura a atividade enzimática;
classificados como competitivos, acompetitivos, não-competitivos e mistos,
segundo o efeito que produzam nas constantes cinéticas Km e Vmax.
Este efeito dependerá da união do inibidor à enzima E, ao complexo
enzima-substrato ES ou a ambos.

Irreversíveis: quando o inibitor inativa de modo permanente a enzima.

Geralmente produzem modificações covalentes de resíduos do centro
catalítico da enzima.
Estas reacções decaem de forma exponencial e são habitualmente
saturáveis.
Abaixo dos níveis de saturação, mantêm uma cinética de primeira ordem em
relação ao inibidor.