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Cromatografía
La cromatografía es una técnica de
separación de los componentes de una
muestra por distribución entre dos fases,
una de ellas fija ó estacionaria y la otra
móvil. La fase estacionaria puede ser
sólida ó líquida (soportada en un sólido ó
gel) y la móvil puede ser gaseosa ó líquida
Volumen ó tiempo
CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS
CROMATOGRÁFICAS
clasificación
intercambio iónico FS
exclusión molecular
afinidad
NATURALEZA DE LAS FASES
Naturaleza de la F.E.
Cromatografía
de Gases Líquido adsorbido en un sólido GLC
Sólido GSC
Cromatografía plana
Cromatografía
de líquidos
Cromatografía en columna
Naturaleza de la F.E.
Líquido adsorbido en un sólido LLC
Sólido LSC
Especie orgánica unida a una superficie
sólida AC
Resina de intercambio iónico IIC
Liquido en los intersticios de un polímero
sólido EMC
TIPOS DE INTERACCIONES
FE polar FE apolar
FM apolar FM polar
Película sobre un
soporte sólido
TIPOS DE INTERACCIONES
líquido FM FE sólida
líquido FM FE gel
Polímero sólido
no iónico de
tamaño de poro
controlado
TIPOS DE INTERACCIONES
Cromatografía de afinidad
La separación depende de las FM + Muestra
interacciones muy específicas
entre el analito y las moléculas
(ligandos de afinidad)
covalentemente unidas
(inmovilizadas) a la FE
Moléculas inmovilizadas FE
Inhibidor
enzimático Tipo especial de cromatografía de adsorción
Ag, Ac especialmente utilizada en bioquímica
Tipo especial de cromatografía de adsorción
especialmente utilizada en bioquímica
Eluato
PROCEDIMIENTO GENERAL Instrumentación
Columna: Detector:
Parámetros característicos
de la separación cromatográfica
Parámetros de Retención
Informan sobre la distribución del F.M. soluto
analito entre las dos fases
soluto
Tiempo de retención (tR)
F.E.
Tiempo muerto (tm)
Tiempo de retención ajustado (t´R)
Velocidad lineal migración de F.M. (u)
Factor de capacidad (k´)
Factor de selectividad (’)
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
t0.-tiempo requerido para que la F.M. t’R.- tiempo desde el máximo del pico
atraviese la columna sin retención de la especie no retenida hasta el
máximo del compuesto eluido. Tiempo
V0 = t0 x F en la F.E. t’R = tR – t0
tRB t = minutos
tRA V = ml
F = ml / minuto
t0
u = cm / s
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
ui (ni ) m L / tR
u (ni ) s (ni ) m L / t0
t0 1
tR 1 k '
t R t0
k'
t0
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
Puede demostrarse que la señal del detector en función del tiempo es:
a 1 ( t t R )2 / 2( t R2 / N )
S (t ) K e
F 2 (t / N )
2
R
2
16t
N 2
R
w
w
EL NÚMERO DE PLATOS TEÓRICOS ES UNA MEDIDA DE LA
EFICACIA DE LA SEPARACIÓN
Distintos componentes de una mezcla conducen a distintos valores de N
TEORÍA DEL PLATO CROMATOGRÁFICO
Los frentes suelen observarse en sistemas de reparto en los que las interacciones
soluto-FE son débiles comparadas con las soluto-soluto o cuando se inyecta una
gran cantidad de soluto (sobrecarga). En este caso la FE sobrecargada se comporta
Como una fase líquida constituida por el propio soluto. Como “lo semejante disuelve
a lo semejante”, el valor de KD aumenta con la concentración y se produce un frente
VR F t R V2 F 2 t2
L ui t R L2 ui2 t2
VR ui
L 2 2 2 2
F t
V /F L
N R
2 R
/ ui L
t
2
2 2
L
L L 2 2
H 2 L L
N L L
TEORÍA CINÉTICA DE LA CROMATOGRAFÍA
2
L
2
procesos
L2
H H procesos
L
Y estos procesos son fundamentalmente:
• DIFUSIÓN DE REMOLINO
• DIFUSIÓN LONGITUDINAL
• DIFUSIÓN POR RESISTENCIA A LA TRANSFERENCIA DE MATERIA
H H Eddy H LD H TMR
TEORÍA CINÉTICA DE LA CROMATOGRAFÍA
Esto se debe a dos efectos acoplados: uno de flujo (A) que depende del
tamaño de partícula y otro de difusión radial que es proporcional a la
velocidad de la fase móvil (G u). GIDDINGS (1965) demostró que el efecto
Global en la HETP, HEddy es:
En GC, como u es grande
H Eddy
1
A
A H Eddy A
1 1 A E
1 1 En columnas sin relleno
(capilares) H 0
A Gu Gu u Eddy
TEORÍA CINÉTICA DE LA CROMATOGRAFÍA
A 2 d p
d 2
G
p
Dm
DIFUSIÓN LONGITUDINAL
Las moléculas tienden a difundirse por delante y detrás de su zona de
Distribución hacia regiones menos concentradas
B
H LD Es inversamente proporcional a la velocidad
de la fase móvil
u
TEORÍA CINÉTICA DE LA CROMATOGRAFÍA
B 2 m Dm 2 s Ds k '
m y s hacen referencia a la fase móvil y la estacionaria
D es el coeficiente de difusión: del orden de 0.1 cm2/s para gases
y de 10-5 cm2/s para líquidos
es un parámetro que vale 0.6-0.8 en columnas empaquetadas y 1
en las capilares
k’ es el factor de capacidad
En LC Dm = Ds~ 10-5 H LD 0
En GC la contribución es de mayor importancia, especialmente
a bajas velocidades
TEORÍA CINÉTICA DE LA CROMATOGRAFÍA
HTMR Cu
TEORÍA CINÉTICA DE LA CROMATOGRAFÍA
C C s Cm
2
k' d
Cs qc s
1 k '
2
Ds
d p2
Cm m
Dm
A B
H Cu
E u
1
u
B/u es insignificante a velocidades normales
H B
umin 0 2 C
u u
B
umin
C
Para u < umin el término B ensancha
La banda
Para u > umin el término C ensancha
La banda
tRB
tRA
WA WB
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
16tR2B tRB t RA
k ' k A k B'
k 'B 1 '
N 2
Res
k 'A w w 2
1 1 k ' 1 L 1 k '
Res N
4 1 k ' 4 H 1 k '
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
AUMENTAR EL VALOR DE N
Disminuyendo H
• Optimizando el flujo FM
• Reduciendo el tamaño de partícula FE
Optimización del
proceso cromatográfico
Su objetivo es conseguir, en el
menor tiempo posible de análisis,
picos bien separados y definidos
Selección adecuada de FM y FE
Variación de las condiciones experimentales
velocidad de flujo
tamaño de partículas del soporte
temperatura de la columna
longitud de la columna...
APLICACIONES ANÁLITICAS
ANÁLISIS CUALITATIVO
Posición
IDENTIFICA
de los picos
ANÁLISIS CUANTITATIVO
Altura / área
CUANTIFICA
de los picos
CUANTI
tRA tRB
CUALI
APLICACIONES ANÁLITICAS
LA RECTA DE
CALIBRACIÓN Concentración
ó masa de analito
CUANTIFICACIÓN POR CALIBRACIÓN
CALIBRADO EXTERNO
Inyectamos cantidades conocidas del analito a determinar, obtenemos el
cromatograma, determinamos el área del pico y la representamos frente
a la cantidad inyectada, en unidades de masa ó concentración dependiendo
de la naturaleza del detector.
La representación debe conducir a una recta que pase por el origen :
a
A a bC ; a 0 : t ( N 2,95%)
sa
A bC ; C fA La pendiente de la recta de calibrado
es el recíproco del factor de respuesta (f)
del detector para dicho analito b = 1/f
En GC, la inyección manual no es satisfactoria y es necesario utilizar un
PATRÓN INTERNO
La cantidad presente del analito en una muestra se determina interpolando
El área del pico del cromatograma de la muestra (Ax) en la recta
Ax
fAx C x
b
CUANTIFICACIÓN POR CALIBRACIÓN
Ax C x
A C
CUANTIFICACIÓN POR CALIBRACIÓN
A b C
kC
API bPI CPI
CUANTIFICACIÓN POR CALIBRACIÓN
A b Cx Cx
API x bPI CPI CPI
A
Cx CPI
API x
CUANTIFICACIÓN POR CALIBRACIÓN
Ax bCx Ax Cx
a a
La medida del volumen debe ser
Ax b(Cx C ) Ax Cx C a
a reproducible o usar PI
A b(C x C ) bC x bC a bC
a
x ,i i
a
i
a
i
a
a
Cx
b
Cuando Axa, j 0 C x C aj
CUANTIFICACIÓN POR CALIBRACIÓN
NORMALIZACIÓN DE ÁREA
El % de área de cada componente se toma como % en peso, corregido por el
factor de respuesta
% X 100 Ax f x
Si i, j fi f j : % X 100 Ax
A f A
i i i
i i
REQUISITOS:
Todos los componentes han de ser eluidos
Todos los componentes tienen que ser detectados
Todos los analitos han de tener el mismo factor de respuesta
BIBLIOGRAFÍA
D.C. Harris, Análisis Químico Cuantitativo,
Reverté, 1999
D.A. Skoog & J.J. Leary, Análisis Instrumental,
McGraw-Hill, 1993
L. Hernández & C. González, Introducción al
análisis instrumental, Ariel Ciencia, 2002
F. Rouessac & A. Rouessac, Métodos y
Técnicas Instrumentales Modernas, McGraw-
Hill, 2000