Histoquímica de pigmentos

Jorge Carrasco Sanhueza

Tecnólogo Médico
Morfofisiopatología y Citodiagnóstico
Hospital Dr. Luis Calvo Mackenna
Definición de pigmentos

• Sustancias naturales , que poseen color

• Presentes en tejidos vivos y absorben espectro lumínico.

• Difieren en origen, constitución química y significado

biológico.

• Absorben un espectro electromagnético entre 400 y 800 nm.

• Pueden ser orgánicos o inorgánicos, son insolubles en la
mayoría de solventes.
Clasificación general de pigmentos
• 1.- Origen endógeno

– 1.1.- Pigmentos endógenos

• a.- Hematogenos
• b.- No hematogenos
– 1.2.- Minerales endógenos

• 2.- Origen exógeno

– a. Pigmentos y minerales exógenos

– b. Pigmentos artefactuales
1.- Pigmentos de origen endógeno

• Se producen en el tejido , cumplen alguna función

fisiológica, o son producto de un proceso metabólico.

• Pigmentos endógenos
– Hematogenos
– No hematogenos

• Minerales endógenos
 1. Pigmentos de origen endógeno:
origen de su acumulación

1. Alteraciones metabólicas con productos celulares normales

(ritmo metabólico inadecuado)

2.- Alteraciones genéticas que afectan el metabolismo normal

3.- Acumulación de sustancia anormal.

– Acumulos intracelulares o daño celular

1. Pigmentos de origen endógeno:
origen de acumulación
2.- Pigmentos de origen exógeno

• Pigmentos que ingresan al organismo por accidente (por

inhalación o a través de la piel), la mayoría de los pigmentos
exógenos son minerales con poca pigmentación. No cumple
funciones fisiológicas.

• Los de origen artefactual son producto de la interacción de los

tejidos con sustancias químicas durante el procesamiento.

– Pigmentos y minerales exógenos

– Pigmentos artefactuales
Clasificación general de pigmentos
• Pigmentos endógenos • Pigmentos artefactuales
– Hematogenos – Formalina
– Malaria
• Hemosiderina – Schistosoma
• Hemoglobina – Mercurio
• Pigmentos biliares – Oxido crómico
– Almidón
– Sales de mercurio
– No hematogenos – Precipitados de plata
• Melanina
• Pigmentos y minerales exógenos
• Lipopigmentos – Pigmento de tatuajes
– Tatuaje de amalgama
– Minerales endógenos – Humo de tabaco
– Carbón
• Calcio – Silicio
• Cobre – Asbesto
– Plomo
– Berilio y aluminio
– Plata
1.1- PIGMENTOS ENDOGENOS:
a. De origen hematogeno

Estos pigmentos son derivados de la sangre

– Hemosiderina
– Hemoglobina
– Pigmentos biliares
– Hemofucsina (ceroide)
1.1.a.- Pigmentos de origen hematogenos:
Hemosiderina
• Pigmento de color amarillo-café, intracelular y se
acumula en macrófagos(hemosiderofagos).

• Compuesto insoluble formado por hidróxido férrico mas

una proteína llamada apoferritina

• De vital importancia para el transporte de oxigeno en la

hemoglobina
• 30% del hierro se almacena en el sistema
retículoendotelial, especialmente en la medula ósea.
• El hierro se incorpora en la formación de la hemoglobina
durante la formación de hematíes.
1.1.a.- Pigmentos de origen hematogenos:
Hemosiderina
• Por exceso de hierro (transfusión sanguínea o
problemas metabólicos) se produce sobrecarga de
hemosiderina.

• Por descomposición de la hemoglobina en la globina

y el grupo hemo, y posteriormente de éste en
hemosiderina y biliverdina.

• Se deposita en el SRE ( bazo, m.o , hígado y riñones)

Hemosiderosis.
1.1.a.- Pigmentos de origen hematogenos:
Hemosiderina
• Soluble en ácidos
• insoluble en álcalis, alcohol y agua
• La formalina no remueve iones férricos

Ferritina

Grupo Hemo 
1.1.a.- Pigmentos de origen hematogenos:
Hemosiderina
• MÉTODO DE PERL’S PARA IONES FÉRRICOS
• Detecta depósitos de Ferritina o hemosiderina que contienen
Fe+3

• Se tratan tejidos con solución de ferrocianuro y HCL

• El HCL desenmascara el hierro de su forma de hidróxido

Fe(OH)3
• El ferrocianuro se une a los iones de fierro +3 y forma un
compuesto coloreado insoluble de color azul

• 4Fe+3 + 3[Fe(CN)6]-4  Fe4[Fe(CN)6]3

• Sustrato + Reactivo  Producto final coloreado azul
1.1.a.- Pigmentos de origen hematogenos:
Hemosiderina

• Dependiendo de la cantidad de hierro se puede necesitar

mas tiempo de tinción

• La solución de HCL y ferrocianuro se debe preparar al

momento de usar

• Se debe usar control positivo, ej: Pulmón postmortem

producto de falla cardiaca .

• Se puede contrastar con fast red o safranina

• Otros métodos son menos utilizados como:
– Método de Lillie para iones férricos y ferrosos
– Método de Hukill y Putt’s para iones férricos y ferrosos
Pearls contrastado con fast red
Pearls contrastado con fast red
1.1.a.- Pigmentos de origen hematogenos:
Hemoglobina
• Es una proteína básica conjugada responsable
del transporte de O2 y CO2 en la sangre .
• Posee un color rojo debido a su grupo hemo
unido a la globina.

Hemoglobina

Grupo Hemo 
1.1.a.- Pigmentos de origen hematogenos:
Hemoglobina
• TECNICA DE LA BENCIDINA

• Aplicada sobre tejidos fijados en formalina e

incluidos en parafina

• Se ha dejado de utilizar debido al efecto

carcinógeno de la bencidina

• Se basa en una reacción denominada

“pseudoperoxidásica”
1.1.a.- Pigmentos de origen hematogenos:
Hemoglobina
• TECNICA DE LA BENCIDINA
• La hemoglobina libera oxigeno a partir de agua
oxigenada  este oxida la bencidina que es
incolora hacia un compuesto de color verde

• Actualmente se puede utilizar diaminobencidina

que posee menor riesgo carcinógeno ???
Reacción de pseudoperoxidasa en
eritrocitos por técnica IHQ
1.1.a.- Pigmentos de origen hematogenos:
Pigmentos biliares
• Pertenecen a este grupo la
bilirrubina, biliverdina y
hematoidina, todos con
propiedades físicas y químicas
distintas

• El grupo hem se fragmenta

formando iones férricos y el
anillo pirrolico

• Este anillo sin su ion de hierro se

denomina biliverdina de color
verde a azul
1.1.a.- Pigmentos de origen hematogenos:
Pigmentos biliares
• La biliverdina se transporta a
los riñones en donde se
reduce a bilirrubina de color
amarillo anaranjado

• En hemorragias antiguas
como en bazo o cerebro se
forma un depósito
extracelular denominado
hematoidina de color amarillo
brillante
1.1.a.- Pigmentos de origen hematogenos:
Pigmentos biliares
• Los métodos de estudios están destinados para los
pigmentos biliares y hematoidina
• Microscópicamente son parecidos a la Lipofucsina .

• Diferencia: Los pigmentos biliares no son

autofluorescentes y no generan birrefringencia, la
lipofucsina si.

• Los pigmentos biliares en casos de ictericia acentuada

puede acumularse en túbulos renales

• En general los acúmulos son de color café-amarillento

Pigmento biliar en túbulos renales
1.1.a.- Pigmentos de origen hematogenos:
Pigmentos biliares
• TECNICA DE GMELIN PARA PIGMENTOS BILIARES
Y HEMATOIDINA

• No es una técnica permanente.

• Se utiliza acido nítrico sobre cortes

desparafinados, en donde se genera un cambio
de coloración progresivo de estas sustancias que
va desde:

• Amarillo  verde  azul morado  rojo

1.1.a.- Pigmentos de origen hematogenos:
Pigmentos biliares
• TECNICA DE HALL PARA BILIRRUBINA
• Tejido fijado en formalina-parafina, es
permanente.

• Utiliza el reactivo de Fouchet recién preparado

(Acido ticloroacetico y cloruro férrico)

• La bilirrubina adquiere un color verde.

• Se contrasta son solución de Van Gieson

Técnica de Hall para bilirrubina
1.1.b.- Pigmentos de origen no hematogenos:
Melanina
• Es un pigmento que varia de color café claro a negro

• Se encuentra normalmente en melanocitos de la piel,

en ojos, folículos pilosos, sustancia gris del cerebro.

• Bajo condiciones patológicas se encuentra en:

– Células tumorales de nevos benignos
– Melanomas
– Lesiones melánicas
– Melanosis
– Hiperpigmentaciones
1.1.b.- Pigmentos de origen no hematogenos:
Melanina
• Se produce a partir de tirosina

• Por acción de la tirosinasa (DOPA oxidasa),

actúa lentamente produciendo DOPA
(dihidroxifenilalananina),

• La DOPA reacciona con la misma enzima

polimerizando y formando melanina.
1.1.b.- Pigmentos de origen no hematogenos:
Melanina
• La melanina y sus precursores (DOPA) son
capaces de reducir plata y ferrocianuro.

• Son insolubles en solventes orgánicos, debido

a que se unen a proteínas en los melanosomas

• Se puede blanquear por agentes oxidantes

fuertes
1.1.b.- Pigmentos de origen no hematogenos:
Melanina
Métodos de estudio

• Fontana-Masson
• Schmorl’s con ferrocianuro-férrico
• Método enzimático de reacción DOPA
• Fluorescencia
• Inmunohistoquimica
Melanina en piel con H-E
1.1.b.- Pigmentos de origen no hematogenos:
Melanina
• REDUCCIÓN DE PLATA DE FONTANA-MASSON

• Sustancia argentafin

• Es inespecífica (hierro, lipofucsina y gránulos argentafines)

• Se utiliza una solución de plata amoniacal durante 30 a 40

minutos a 56 ° C.

• Se puede contrastar con rojo nuclear o safranina

• La melanina adquiere un color negro intenso

Fontana masson, contraste con rojo
nuclear
Fontana Masson, contraste con
safranina
1.1.b.- Pigmentos de origen no hematogenos:
Melanina
• REDUCCIÓN DE SCHMORL’S
• La melanina reduce el ferricianuro a ferrocianuro
produciendo un color azul
• Método inespecífico, puede teñir lipofucsina,
pigmento biliar y gránulos neuroendocrinos

• Utiliza una solución de ferricianuro de potasio y

cloruro férrico, preparada antes de usar.

• Se puede contrastar con rojo nuclear o safranina.

• La melanina adquiere un color azul oscuro

Reducción de Schmorl’s
Reducción de Schmorl’s sin contraste
1.1.b.- Pigmentos de origen no hematogenos:
Melanina
• MÉTODO DE DOPA OXIDASA

• Utiliza la capacidad de la enzima DOPA oxidasa

presente en los melanosomas para oxidar
DOPA y formar un compuesto insoluble de
color café.

• Altamente especifico para la melanina

1.1.b.- Pigmentos de origen no hematogenos:
Melanina
• MÉTODO DE DOPA OXIDASA
• Debe usarse en cortes por congelación.

• Utiliza dihidroxifenilalanina en tampón fosfato a

pH 7.4
• Se incuba durante 45 minutos a 37° C
• Utiliza contraste de verde metilo

• Las zonas con actividad DOPA-oxidasa adquieren

color negro-parduzco
Método de DOPA-oxidasa
1.1.b.- Pigmentos de origen no hematogenos:
Melanina
• Método de IHQ
– Es mucho mas especifica
– Utiliza anticuerpos HMB-45, Melan-A y S100 para
los cuales la melanina es +

• Blanqueamiento de la melanina
– Utiliza H2O2 10% durante 1 a 2 días
– También KMNO4 al 0,25% y acido oxálico al 5%
IHQ con HMB-45 en piel
1.1.b.- Pigmentos de origen no hematogenos:
Lipopigmentos
Lipofucsina
• De color amarillo-café a rojizo-café
• Producto de procesos oxidativos de lípidos y
lipoproteínas.
• Oxidación lenta y progresiva de lípidos.
• El pigmento proporciona una tinción variable,
con diferentes colores, diferentes tamaños y
textura.
1.1.b.- Pigmentos de origen no hematogenos:
Lipopigmentos
• Lipofucsina
• Se puede encontrar en procesos fisiológicos o
patológicos, generalmente de células envejecidas
– Hepatocitos, mezclados con otros pigmentos
– Células musculares cardiacas de personas ancianas
– Corteza adrenal en pacientes tras prolongado stress
– Testículos, especialmente en células de leydig
– Ovario, tras la involución a cuerpo lúteo
– Cerebro tras hemorragia o infarto
– Desordenes lipídicos
Células con acumulo de pigmento
lipofucsina
Lipofucsina en hígado
1.1.b.- Pigmentos de origen no hematogenos:
Lipopigmentos
• Se puede demostrar por diversos métodos:
– Reacción de PAS
– Reducción de Schmorl’s
– Método de Zhiel-Neelsen
– Sudan Black B
– Aldehído Fucsina de Gomori
– Fontana Masson
– Etc.
Lipofucsina con método de Kluver-
Barrera
1.1.b.- Pigmentos de origen no hematogenos:
Lipopigmentos
• Pigmento ceroide
• Es una lipofucsina de fase inicial .
• Características químicas distintivas de la
lipofucsina
– Adopta un color parduzco
– Es PAS negativa
– Sudan Black negativa
– Azul de Nilo negativo

• Posee autofluorescencia y también se tiñe con el

método de Zhiel-Neelsen
2.a.- Pigmentos de origen exógeno:
Pigmentos y minerales exógenos
• Pigmento antracótico
– Acúmulo de carbono exógeno que se produce tras
inhalación a través de los pulmones y que puede
provenir de Smog, polvo y humo de tabaco

• Pigmento de tatuajes
– Tintes con óxidos de hierro u orgánico son digeridos por
macrófagos que almacenan el material de por vida.

• Tatuaje de amalgama
– es una lesión benigna causada por la implantación de
material de relleno dental en los tejidos
Pigmento antracotico en pulmón
Tatuaje cutáneo
Tatuaje por amalgama
2.a.- Pigmentos de origen exógeno:
Pigmentos artefactuales
Pigmento formolado
• Acción de acido fórmico sobre el
grupo hemo de la hemoglobina
sobretodo en tejidos
hemorrágicos

• Se elimina con ácido pícrico

saturado en etanol durante 1 hora
2.a.- Pigmentos de origen exógeno:
Pigmentos artefactuales
Pigmento malarico
• se observa en macrófagos de diversos órganos junto a
hemosiderina. Es negro y granular.
• Producido por los plasmodios de la malaria a partir de
la hemoglobina, contiene fierro difícil de evidenciar.
• Se observa especialmente en el hígado, bazo, ganglio
linfático, que adquieren un color gris o gris negruzco.
2.a.- Pigmentos de origen exógeno:
Pigmentos artefactuales
Pigmento de sales de mercurio
• precipitados de color negro-café
interfieren con la morfología normal
del tejido 

Pigmento de oxido crómico

• Tras la fijación , lavar los tejidos
durante 12 a 48 horas en agua
corriendo para evitar la formación de
precipitados pigmentados
PARA CLASE DE HISTOQUIMICA DE
IONES INORGANICOS
• Minerales endógenos
– Cobre
– Calcio
• Pigmentos y minerales exógenos
– Carbón
– Silicio
– Asbestos
– Plomo
– Berilio y aluminio
– Plata

– ETC